Vamos falar de análise cromatográfica de canabinóides?

No Brasil a importação de extratos medicinais de Cannabis foi regulamentada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) através da RDC Nº 17/2015 após o Conselho Federal de Medicina (CFM), Resolução RE Nº 2.113/2014, autorizar a prescrição compassiva de canabidiol para tratamento de epilepsias refratárias aos tratamentos convencionais. Em 2016 a ANVISA incluiu na autorização de importação para uso médico pessoal, através da RDC 66/2016, a planta Cannabis sativa L., partes da planta e de seus compostos, incluindo o THC. Um ano depois foi registrado no Brasil o medicamento Mevatyl®, indicado para controle da espasticidade na esclerose múltipla, constituído por extrato hidroalcoólico de Cannabis sativa L. contendo 27 mg mL-1 de THC e 25 mg mL-1 de CBD, além
de outros canabinoides minoritários e terpenos.

Diversos compostos formados no metabolismo secundário desta planta são de interesse farmacológico, especialmente os canabinoides (terpenofenólicos). Os compostos majoritários são o ácido tetrahidrocanabinólico (THCA) e ácido canabidiólico (CBDA), que quando convertidos às suas formas neutras tetrahidrocanabinol (THC) e o canabidiol (CBD), apresentam efeitos farmacológicos paradoxais no Sistema Nervoso Central. O THC é psicoativo com propriedades
euforizantes, enquanto o CBD é depressor com propriedades anticonvulsivante e ansiolítica.
O THC ainda apresenta efeito antiemético e analgésico e o CBD efeito antipsicótico e anti-inflamatório.

A Figura 1 apresenta os principais canabinóides de interesse em produtos farmacêuticos e que necessitam de controle de qualidade.

Figura 1. Principais canabinoides de interesse farmacológico e que necessitam de controle de qualidade

Métodos por cromatografia gasosa (CG) e CLAE são descritos na literatura para determinação de canabinoides em diferentes matrizes, além de outros métodos ainda pouco difundidos como a cromatografia em fluido supercrítico. Também se associa métodos de TLC?HPTLC para obtenção de perfis cromatográficos dos extratos vegetais.


Os métodos por CG, apesar de rápidos, robustos e muito eficientes, requerem
derivatização dos canabinoides ácidos pois o CG necessita de volatilidade e substâncias termicamente estáveis, pois opera com altas temperaturas para favorecer a separação e os canabinoides ácidos não atendem essa condição, necessitando de transformação química. A derivatização introduz erros, pois representa uma reação adicional prévia a análise, sendo essa um desvantagem associada ao CG.

Assim, quando a análise de canabinoides se destina ao controle de qualidade de produtos farmacêuticos e suplementos alimentares, os métodos por HPLC representam a melhor alternativa de análise, pois permitem a análise simultânea dos canabinoides ácidos e neutros, permitindo o controle de qualidade de extratos vegetais de Canabis sativa. A Figura 2 e 3 apresentam exemplos de cromatograma obtido por HPLC e CG, respectivamente.

Figura 2. Cromatograma obtido por HPLC para canabinoides.
Perfil cromatográfico de canabinoides obtidos por CG: maior eficiência e resolução, porém necessidade de derivatização.

O método a ser empregado precisa considerar a análise de CBD e THC para controle e proteção de fatores de saúde pública. Em vários países a presença de THC em produtos medicinais de Canabis é considerado proibido, sendo então o THC uma impureza que precisa ser controlada rigidamente.

A Tabela 1 apresenta algumas opções de métodos empregando a CG e a Tabela 2 destaca as principais condições a serem consideradas.

Tabela 1. Algumas opções de métodos por CG para análise de canabinoides.
Tabela 2. Condições importantes a serem consideradas no método por CG.

Canabinóides com grupos carboxílicos e descarboxilados podem ser detectados em cromatografia líquida em 228 nm, apesar da sensibilidade dos detectores UV e PDA serem menores do que outros.

A Tabela 3 apresenta algumas opções de métodos empregando a cromatografia líquida para análise de canabinoides.

Tabela 3. Algumas opções de métodos por HPLC para análise de canabinoides.

Assim, a cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) e a técnica tandem (LC-MS/MS) permitem desempenhos de destaque em termos de melhoria de seletividade e sensibilidade. Porém, é necessário o uso de padrões na forma de isótopos estáveis para permitir um melhor resultado quantitativo e melhores exatidões, contornando efeitos matriz. Entretanto, padrões deuterados de poucos canabinóides estão comercialmente disponíveis, como: THCA-d3, CBD-d3, THC-d3 e CBN-d3. Os padrões puros de canabinóides carboxilados tendem a ser instáveis em solução.

Em relação a técnica de ionização, tanto o eletrospray (ESI) quanto a ionização química a pressão atmosférica (APCI) podem ser usadas como interface no LC-MS, porém, em geral, somente gera-se as moléculas protonadas, sendo necessário o uso do LC-MS/MS para melhorar as características confirmatórias do método. Além disso, como os canabinóides contendo os grupos fenólicos e carboxílicos não são eficientemente ionizados por ESI e APCI, a sensibilidade da técnica de LC-MS é reduzida quando comparado com o método empregando a GC-MS.

A Tabela 4 apresenta um comparativo entre o limite de detecção e quantificação das diferentes técnicas de HPLC e GC para análise de canabinóides.

Tabela 4. Comparativo de desempenho dos métodos de HPLC e GC.

Os desafios ainda são recentes e como para qualquer amostra, devemos investir em desenvolvimento de métodos. Porém, os recursos e tecnologia hoje nos permitem muitas opções promissoras de estabelecer condições realmente seguras para o uso desta planta que apresenta tantas propriedades intrigantes e poderosas.

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Se quiser saber mais sobre desenvolvimento de métodos nos procure

Quantificação em análises cromatográficas: análise indireta

As técnicas cromatográficas, como o HPLC, são técnicas analíticas indiretas. Isso significa que necessitam de padrões de concentração conhecida para calibração e determinação de uma equação que descreva a relação entre o sinal analítico e a concentração (y= f(x)).

Avaliação da linearidade para a correlação entre y e x (y=f(x)).

Sem que se estabeleça uma equação confiável não se torna confiável também determinar a concentração de amostras desconhecidas.

A calibração deve ser feita com padrões da própria substância a ser analisada, pois a maioria dos detectores tem sinais Analíticos que dependem da estrutura química, o que causa erros, podendo-se considerar a análise, nesta situação, como semi-quantitativa (em algumas quantificações de impurezas isso ocorre devido a ausência de padrões).

As calibrações podem ser externas, internas ou do tipo adição de padrão.

Calibração externa: soluções de padrões são injetadas e as áreas são obtidas para determinar a correlação x e y.
Calibração por adição de padrão: a solução de padrões são adicionadas a soluções contendo uma quantidade de amostra.
Calibração interna: outra substância (padrão interno) é adicionado em todas as soluções, tanto de amostras quanto de padrões e a relação de área do pico do analito e do padrão interno é usada para traçar a curva de calibração.

A calibração por adição de padrão é essencial quando a matriz é complexa e interfere na resposta analítica. Sempre será importante determinar a faixa linear das curvas de calibração.

Você pode saber mais sobre linearidade em nosso curso de validação, ou aprender a técnica de quantificação por HPLC em nosso curso de Operação de HPLC: INSCRIÇÃO CURSO DE VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS – RDC 166/2017, ICH Q2, TESTES ESTATÍSTICOS – CROMVAL Lab – Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão e CURSO PRESENCIAL OPERAÇÃO DE HPLC: DO ZERO AO 100% – CROMVAL Lab – Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão

Algumas informações sobre quantificação de impurezas pode ser obtidas em: Como quantificar impurezas orgânicas e/ou produtos de degradação? – CROMVAL Lab – Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão

Qualquer dúvida escreva: cromvallab@gmail.com

COMO INICIAR UM DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO POR HPLC?

As técnicas cromatográficas são de suma importância nas diferentes áreas industriais e acadêmicas. Dentre os tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com certeza se destaca como a técnica mais versátil e portanto a de maior aplicação.

Porém, para obter uma boa condição de análise os métodos de HPLC necessitam de estudo e desenvolvimento. Condições de preparo de amostra, melhor coluna/fase estacionária, fase móvel, volume de injeção, detectores, entre outros, são alguns parâmetros a serem definidos para permitir separação eficiente e quantificação exata.


Por onde iniciar quando não temos uma referência de método completo?

1 – Pesquisa Bibliográfica:

Obter informações sobre o Analito e sobre a amostra. Principais perguntas:
A) O que eu preciso analisar absorve no UV ? Se não, terei que verificar outro detector. Se sim,  qual o melhor comprimento de onda?

Exemplo de espectro de absorção com 2 máximos: um no comprimento de onda de 255 nm e outro na região do visível, em 395 nm. Com a detecção nos máximos de absorção é possível obter as melhores sensibilidades.

B) Qual é o melhor solvente/ preparo de amostra? É necessário extração? Pré concentração? 


C) qual pka? Teremos que ajustar o pH ou trabalhar com par iônico? Troca iônica? (no caso de estar dissociada na forma de íons).

 D) Qual logP dos solutos?

Com esta informação podemos definir qual tipo de separação será melhor: – fase reversa: log P entre 5 a quase zero- fase normal: log P entre 0 e -1- HILIC: log P entre -1 a -4- troca iônica: log P menor que -4


B) sabendo qual o melhor tipo de separação podemos definir o tipo de FE a ser utilizada e já definiremos as características da FM compatível (que também tem que ser compatível com a amostra: deve-se testar a solubilidade).

Tipos de solventes para fase reversa e fase normal e triângulo de seletividade.

C) a escolha da coluna,  após escolher o tipo de FE, irá depender da rapidez desejada e eficiência necessária. Se houverem muitos picos a serem separados vale a pena investir em uma coluna de menor diâmetro e menor tamanho de partícula (mais caras).  Se o equipamento disponível for um UHPLC é possível trabalhar com coluna ainda mais eficientes (diâmetros e tamanho de partícula da ordem de 2 mm e 1,3 um, respectivamente).

Exemplos de algumas dos mais usados tipos de fases estacionárias.
Opções modernas de FE.
Exemplo da influência de algumas variáveis geométricas de colunas e eficiência obtida.
Alternativas mais modernas de FE.

Com certeza a modernização das fases estacionárias e colunas fez com que o HPLC/UHPLC conseguisse atingir novos patamares e permitiu se destacar em vários desafios, mas também tornou o desenvolvimento dos métodos mais delicado e com maior necessidade de estudo.

Outras definições de condições analíticas, como: vazão de fase móvel, temperatura e volume de injeção merecem atenção, mas acabam sendo definidas também de acordo com as características das e FE.

Precisa de ajuda no desenvolvimento? Gostaria de se aperfeiçoar nesta área?

Nos escreva: cromvallab@gmail.com

Abraços!

Como ocorre o registro de novos produtos pela ANVISA?

Com as recentes discussões sobre a aprovação, ou não, das vacinas direcionadas para combater a pandemia causada pelo COVID-19, evidenciou-se de forma singular a atuação e importância da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) na manutenção e defesa da saúde pública.

Entre as diferentes atuações administrativas da ANVISA, o controle de registro de Insumos Farmacêuticos Ativos (IFA) direcionados para a produção de novos produtos farmacêuticos.

Além das inerentes preocupações em garantir a correta ação farmacológica, a qualidade, segurança e eficácia norteiam os trabalhos e a elaboração da documentação que deve comprovar que o IFA/produto acabado podem ser disponibilizados.

Um portal em particular, o COIFA (desenvolvido pela Coordenação de Registro de Insumos Farmacêuticos Ativos) auxilia muito e permite direcionar os esforços das indústrias farmacêuticas na correta direção da elaboração dos melhores dossiês para análise.

A Figura abaixo representa a página inicial do portal, acessado no endereço: http://coifa.anvisa.gov.br

Através do COIFA da ANVISA é possível verificar as principais RDC que norteiam a elaboração da documentação de registro, guias internacionais relacionados (como os guias do ICH), farmacopeias que descrevem as monografias e métodos a serem empregados e auxilia na verificação de limites a serem estabelecidos em especificações de controle de qualidade dos IFA/produtos acabados.

Neste portal ainda é possível acompanhar o andamento de processos submetidos e quais produtos estão regulares, ou não, frente ao registro na ANVISA.

Assim, o COIFA desempenha um papel interessante para os profissionais que atuam no desenvolvimento de produtos farmacêuticos e registro dos mesmos, mas também viabiliza que o público em geral possa ter conhecimento sobre aspectos regulatórios.

Pensando em divulgar este portal, preparei uma pequeno vídeo sobre a utilização destas ferramentas.

Endereço do vídeo no YouTube: https://youtu.be/QSzzLRoW78M

Espero que gostem!

Abraços!

CROMATOGRAFIA A GÁS (CG): UMA TÉCNICA MADURA MAS QUE AINDA PODE TRAZER SURPRESAS

Os primeiros equipamentos de CG foram colocados no mercado na década de 40 e 50. Desde essa época, várias melhorias foram introduzidas e hoje pode-se considerar que a CG é uma técnica “madura” da qual se espera poucos avanços tecnológicos. O acoplamento com a espectrometria de massas também já está bem consolidado, completando o nível elevado de performance da técnica. Alguns pontos de melhoria significativos são bem vindos, mas se encontram além da interface do equipamento e são o desenvolvimento de fases estacionárias mais resistentes e flexíveis e preparos de amostra mais rápidos e eficientes.

Em 1991 foi descrita a técnica de GCxGC: cromatografia a gás bidimensional abrangente, com um poder diferencial de solucionar problemas complexos de separação. O professor John B. Phillips introduziu esta técnica que desde então tem sido extensivamente explorada, mas que ainda é desconhecida por muitos.

A GCxGC é caracterizada pela utilização sequencial de duas colunas cromatográficas, uma convencional e a outra curta (do tipo de coluna usada para “fast-GC”), de forma que todo o efluente da primeira coluna ou uma parte representativa do mesmo é conduzido para a
segunda através de um modulador. O sistema de modulação entre as duas colunas causa uma compressão da banda cromatográfica que elui da primeira coluna, e esta banda é direcionada para a coluna curta, de forma que a separação na segunda coluna é extremamente rápida. Os períodos de modulação devem ser ajustados a fim de que sejam compatíveis com o tempo de separação na segunda coluna, minimizando o alargamento da banda comprimida. Desta forma, a sensibilidade é significativamente incrementada (relação
sinal/ruído aproximadamente 10 vezes maior) e a resolução aumenta de forma expressiva, se comparada à cromatografia gasosa monodimensional (1D-GC, “One-Dimensional Gas Chromatography”). A combinação de duas colunas cromatográficas com mecanismos de separação ortogonais entre si leva a um significativo aumento de seletividade.

Esquema do equipamento de GCxGC.

Tais características tornam esta técnica extremamente útil para análise de amostras complexas, ou amostras que apresentem outras características que limitam sua caracterização por 1D-GC, como no caso das separações enantioméricas.
Embora a GCxGC tenha apenas 13 anos, vários moduladores já foram desenvolvidos. Inicialmente, eram utilizadas válvulas ou inserção direta na segunda coluna. Entretanto, a fim de focalizar os analitos em bandas estreitas, tornou-se necessário utilizar gradientes térmicos, seja através de temperaturas elevadas, acelerando-se a eluição do soluto dentro de uma banda estreita (abordagem de varredura térmica – “thermal sweeper”), seja através de sistemas criogênicos, retardando-se a eluição dos analitos e causando um
aprisionamento “on-column”, ou estreitamento das bandas. O primeiro sistema modulador criogênico foi chamado de sistema criogênico longitudinalmente modulado (LMCS, “Longitudinally Modulated Cryogenic System”). Outro sistema modulador deste tipo utiliza dois jatos criogênicos a fim de focalizar os compostos em duas regiões próximas da coluna
capilar, para separar os eventos de aprisionamento e remobilização da amostra. Estes dois últimos moduladores descritos são os mais utilizados atualmente.

Exemplo de equipamento: Ao acionar o modulador um jato de gás nitrogênio refrigerado é projetado sobre uma pequena área do modulador. Durante certo período, a banda cromatográfica sofre um efeito de compressão/estreitamento devido à ação da baixa temperatura, fazendo com que os analitos sejam concentrados neste local da coluna. Em seguida, o fluido criogênico cessa e o modulador libera a banda cromatográfica e esta é introduzida na segunda coluna. A liberação ocorre pela incidência de um jato quente na mesma região. Neste sistema todo o efluente da primeira coluna é transferido para a segunda e, por isso, a técnica é também chamada de abrangente ou compreensiva, sendo que as análises da primeira e segunda dimensão se processam simultaneamente e o tempo total de análise equivale ao tempo empregado na análise monodimensional (https://www.shimadzu.com.br/analitica/produtos/gc/gcxgc-qms.shtml).
Resultados obtidos com a GCxGC.

Os resultados obtidos por GCxGC as vezes podem ser difíceis de interpretar e diferentes pesquisadores escolhem diferentes formas de representar os dados obtidos (exemplo 1). Uma opção são os gráficos de contorno, como no exemplo 2 abaixo.

GcxGC Analyzer

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Quais os principais motivos para exigências em processos de registro e pós registro?

No dia 22 de outubro a Gerência de Avaliação da Qualidade de Medicamentos Sintéticos (GQMED) da ANVISA ofereceu um Webinar para discutir os principais motivos de exigênca e indeferimento no processo de registro e de pós registro de medicamentos sintéticos.

Repetindo aproximadamente o mesmo perfil levantado anteriormente em 2015, os dados mostram que os relatórios de validação estão em destaque, seguidos de relatórios de estabilidade e produtos de degradação e controle de qualidade.

*outros incluem itens diversos, mas com menos de 10 itens relacionados

Os principais motivos que fazem com que a validação seja um dos principais pontos de exigências e indeferimento, envolvem documentos faltantes/ausentes ou não cumprimento em prazos de resposta de itens relacionados com a qualidade.

No caso da validação de métodos os principais pontos apontados foram:

  • Não apresentar validação / ou validação parcial: a validação é sempre necessária, mesmo quando o método é farmacopeico (apenas métodos muito simples, como pH e solubilidade são exceções). Métodos desenvolvidos em outra empresa ou local devem apresentar validação parcial e transferência.
  • Divergências apresentadas no relatório de validação em relação a parâmetros do método de controle de qualidade (diferentes colunas, preparo de amostras e etc): a ANVISA considera uma falta de organização a empresa apresentar divergências entre versões de métodos enviados nos dossiês.
  • Ausência de relatório de caracterização de Substâncias Químicas de Referências (SQR): quando se utiliza “padrões” não compendiais é necessário SEMPRE anexar o relatório de caracterização que comprove a identidade e qualidade da substância.
  • Envios de validação de métodos quantitativos, como os que utilizam HPLC e CG para impurezas, como se fossem Ensaios Limites: métodos quantitativos sempre necessitam de validações incluindo precisão, exatidão linearidade e LQ (se forem de impurezas). Alguns métodos colorimétricos e, eventualmente, TLC podem ser considerados ensaios limites.
  • Não apresentar dados de pureza de picos: deve-se usar o software do equipamento para calcular o purity angle e o threshold (pico puro = purity angle< threshold angle). A pureza deve ser maior ou igual a 0,99 e resultados de 0,90 a 0,99 devem ser especificamente justificados, os cromatogramas e resultados devem ser incluídos e a falta de pureza requer reavaliação do método. SELETIVIDADE acaba sendo o item com maior exigências.
  • Não avaliar a seletividade do método em relação a impurezas desconhecidas: mudanças de perfil de impurezas devem ser investigadas, deve-se evidenciar a injeção de impurezas conhecidas e seus tempos de retenção, deve-se incluir um system suitability com controle de resolução para casos de resolução complicada. SELETIVIDADE acaba sendo o item com maior exigências.
  • Considerar um limite aceitável inadequado para interferências, por exemplo de 2 % para placebo. Tais limites poderiam ser justificáveis somente no caso de dissolução por UV, mas para métodos cromatográficos são inaceitáveis. SELETIVIDADE acaba sendo o item com maior exigências.
  • Enviar a seletividade sem a degradação forçada: deve-se atender o descrito na RDC 166/2017 e a RDC53/2015.
  • Enviar a linearidade com faixa inadequada: teor 80 a 120%, uniformidade 70 a 130%, 50 a 150% é aceitável. Especial atenção deve ser dada no caso de métodos que monitoram teor e impurezas ao mesmo tempo, pois estes devem ter um faixa linear inteira – deve-se incluir mais pontos, se necessário, ou usar o ativo mais diluído. Se não houver linearidade deve-se considerar alterar o modo de calibração externa.
  • Definir o fator resposta inadequadamente: deve-se utilizar a linearidade, em especial o coeficiente angular e no caso de revalidação este item deve também ser revisto.
  • Utilizar réplicas na precisão e exatidão não verdadeiras: as replicatas devem ser preparadas desde a pesagem: utilizar a mesma solução mãe não é aceitável na maior parte das ocasiões.
  • Apresentar limites incoerentes para precisão e exatidão: se a especificação de IFA for 98-102% não é adequado um DPR de 5% (especificações de 95-105% também não seria); métodos de HPLC que só incluem pesagem e preparos simples devem ter limites de 2%. O critério de aceitação deve ser baseado em: concentração de analito (menores concentrações, maiores DPR aceitáveis), técnica e especificação.
  • Não apresentar precisão e exatidão no limite de quantificação. Critérios para precisão e exatidão podem ser diferentes neste ponto, se justificável
  • Apresentar LQ incoerentes com limites de notificação e identificação (RDC 53/2015). LQ deve ser menor ou igual a estes limites e se a RDC 53/2015 não é aplicável o LQ deve ser no mínimo 50 % do limite de especificação. Verificar a sensibilidade adequada para avaliar a estabilidade.
  • A validação deve ser feita antes da estabilidade.

Dúvidas? Nos procure para consultorias ou participe de nossos cursos disponíveis em plataforma EAD, com direto a 1h de mentoria por vídeo conferência.

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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Você conhece a cromatografia convergente e a cromatografia unificada?

O mecanismo básico de qualquer separação cromatográfica é criar condições para que os analitos presentes em uma mistura se movam através do sistema, com velocidades diferentes o suficiente para permitir serem separados, detectados e quantificados.

A primeira regra da fase estacionária é possuir propriedades que retenham e interajam diferentemente pelos analitos enquanto a fase móvel força os analitos a se moverem até a saída do sistema.

Este processo é similar para a cromatografia líquida (LC), cromatografia a gás (GC) e para a cromatografia convergente (CC). A diferença está em como as propriedades da fase móvel interferem na forma que os analitos se separam em cada tipo de sistema cromatográfico.

Cromatógrafo a Gás
Cromatógrafo líqudo
Cromatógrafo convergente (fluido supercrítico).

Em GC, a fase móvel é normalmente um gás inerte e não reativo, tipicamente nitrogênio ou hélio. Nas condições de operação de temperaturas e pressões em GC, a fase móvel não pode solvatar as moléculas do analito ou modificar a superfície da fase estacionária. A fase móvel de CG age como um carregador dos analitos através da coluna. A retenção e separação dos analitos ocorre somente devido a interação das moléculas na fase estacionária.

Esquema de separação para CG, HPLC de FR, HPLC de FN e Cromatografia Convergente.

Em LC, por outro lado, a fase móvel desempenha um papel essencial na otimização da separação, sendo que os analitos , a fase móvel e a fase estacionária participam de equilíbrios que governam a separação. A fase móvel influência na retenção dos analitos, devido a solvatação e também reduzindo a interação e retenção do analito na fase móvel, competindo com a superfície da fase estacionária.

Em cromatografia convergente a tecnologia de separação envolve uso de CO2 comprimido como o principal solvente (fase móvel cromatográfica), em pressões da ordem de 100 a 400 vezes a pressão atmosférica. Muitas vezes o CO2 é misturado com um líquido co-solvente (por exemplo metanol, etanol, isopropanol, acetonitrila) para ajustar as propriedades da fase móvel. Na verdade, a cromatografia convergente (CC) é o nome moderno da cromatografia de fluido supercrítico (SFC).

A SFC foi inventada como uma técnica cromatográfica empregando solventes em condições supercríticas para expandir a capacidade da CG. Para contornar o fato da CG não ser compatível com analitos instáveis termicamente, pesquisadores empregaram pressões elevadas para não necessitar de altas temperaturas. Condições supercríticas foram selecionadas para:

  • aumentar o poder de solvatação de um gás altamente pressurizado
  • evitar condições onde a fase móvel não mais flui como um solvente simples pela variação tanto devido a pressão ou a temperatura ou ambos.

Mais tarde, foi percebido que a variação da densidade do solvente pode modular a força do solvente, que é a principal vantagem de trabalhar com fluido supercrítico. Devido os fluidos serem altamente compressíveis sobre condições supercríticas, mesmo pequenas mudanças na pressão mudam drasticamente a densidade e modificam a retenção do analito. De fato, pode-se criar um gradiente de solvente pela variação de pressão e modular a densidade, eliminando a necessidade de adicionar e variar a proporção de solventes orgânicos para trabalhar com gradientes. Assim, o fluido supercrítico representa a possibilidade de altas eficiências de separação usando um único solvente não tóxico.

Entretanto, tem-se limites pois o CO2 é apolar, mesmo modulando a densidade e para melhorar a separação de moléculas apolares ainda torna-se necessário adicionar solventes mais polares. Isto mudou o rumo do desenvolvimento da SFC, pois ao se introduzir metanol ou outros solventes polares juntamente com o CO2 a separação acaba ocorrendo em condições que não são de fato supercríticas na maior parte do tempo (exemplo: na adição de 60 % de metanol ou mais). Na continuidade deste desenvolvimento se percebeu que a separação já não dependia mais das condições supercríticas e, adicionalmente, os equipamentos se SFC não conseguiam manter a mesma robustez ao trabalhar com CO2 comprimido e obter as mesmas repetitividade e exatidão obtidos em LC ou GC.

Com todas as mudanças, em 2012, a Waters introduziu o Cromatógrafo Convergente de Ultra Performance (UFC²), com significativa alta robustez instrumental.

A palavra “convergente” na Cromatografia Convergente foi utilizada devido a observação de que as tecnologias cromatográficas existentes (LC e GC ) são convertidas em um único sistema. A SFC foi utilizada como “ponte” entre a LC e GC e estender o uso de fase móvel ao redor das condições supercríticas. CC está atualmente cada vez mais sendo usada com co-solventes orgânicos atendendo tanto a região super e subcrítica, expandindo a modulação de densidade de de CO2 anteriormente limitada.

Na prática, além de cobrir um gap entre as aplicações de LC e GC, a CC tem um potencial muito maior do que foi originalmente idealizada.

Alguns pesquisadores defendem este desenvolvimento no que tem sido chamado de Cromatografia Unificada (LC, GC e SFC). De fato, observa-se que o desenvolvimento é amplo e a cromatografia cada vez mais se reafirma como a técnica analítica mais versátil de todos os tempos.

Sistema Nexera UC: conversão de SFC em UHPLC.

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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ICH Q3D: Análise de Impurezas Elementares em fármacos – uso de ICP-OES, ICP-MS e EDX

O guia harmonizado do ICH para impurezas elementares, ICH Q3D, requer o controle de resíduos de 24 elementos (Metais tóxicos), os quais preocupam devido a suas toxicidades. Ele foi publicado em 2015, mas este requerimento começou a ser aplicado em produtos farmacêuticos novos em Junho de 2016 nos Estados Unidos e Europa e em Abril de 2017 no Japão.

Nos produtos já registrados, essas análises começaram a ser implementadas em janeiro de 2018 os Estados Unidos e em dezembro de 2017 na Europa.

No Brasil poucas empresas começaram a atender essa necessidade, e somente após vigência dos capítulos 232 e 233 da USP (em 2018), essas pesquisas se intensificaram.

As principais técnicas indicadas para análise de impurezas elementares são o plasma indutivamente acoplado com espectrometria de emissão ótica (ICP-OES) e plasma indutivamente acoplado com espectrometria de massas (ICP-MS). Porém, o método alternativo empregando espectrometria de fluorescência de raio-x (EDX) também surge como uma alternativa, conforma método USP <735>.

As impurezas elementares são divididas em classes de acordo com a sua toxicidade e os limites são estabelecidos de acordo com os cálculos de Permitted Daily Exposure (PDE) e análise de risco de acordo com as fontes de contaminações:

  • Classe 1: Elementos As, Cd, Hg, and Pb, são tóxicos para os humanos e devem ser limitados ou ausentes nos medicamentos de consumo humano. A presença desses em medicamentos são tipicamente oriundas de materiais comumente usados (excipientes extraídos).
  • Classe 2: Elementos desta classe são geralmente considerados como toxicantes de rota dependentes. São divididos nas subclasses 2A e 2B
  • Classe 2A: Co, Ni and V. Elementos com relativamente alta probabilidade de ocorrência em medicamentos e então requerem análise de risco de todas as potenciais fontes de impurezas e vias de administração.
  • Classe 2B: Ag, Au, Ir, Os, Pd, Pt, Rh, Ru, Se and Tl. Elementos tem uma probabilidade reduzida de ocorrência em medicamentos relacionados com suas baixas abundâncias e baixo potencial de ser co-isolado com outros materiais. Assim, eles podem ser excluídos da análise de risco a menos que sejam intencionalmente adicionados durante o processo de fabricação do fármaco, excipientes ou outros componentes do produto acabado.
  • Classe 3: Ba, Cr, Cu, Li, Mo, Sb, and Sn. Os elementos dessa classe tem relativamente baixa toxicidade por administração oral (alto PDE, geralmente maior que 500 µg/dia) mas pode ser requerido considerar na análise de risco para via de inalação e parenteral.
  • Outros elementos: Al, B, Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, W e Zn. Algumas impurezas elementares para as quais o PDE não foi estabelecido ou que possuem baixa toxicidade inerente, mas que podem representar ameaças diferenciadas ao organismo humano merecem atenção. Exemplo: Al – pode comprometer funções renais; Mn e Zn – podem ser prejudiciais no caso de pacientes com problemas hepáticos).

Tabela 1. Exemplos de parâmetros e resultados de validação para impurezas elementares usando EDX com técnica analítica

Tabela 2. Exatidão (ug/g).

Tabela 3. Resultados obtidos por ICP-MS (ug/g).

Tabelas extraídas da Shimadzu Application News No. X271.

Novos tempos, novos desafios. Neste caso, as principais dificuldades são a implementação dessas novas metodologias, os valores de PDE e o atendimento aos níveis necessários.

Caso deseje uma consultoria na área escreva cromvallab@gmail.com

Os métodos abordados aqui são discutidos no curso de Desenvolvimento de Métodos Analíticos para Desenvolvimento de Produtos.

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

WEBINAR GRATUITO: QUALITY BY DESING APLICADO AO DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS

Inscrições direto no chat do webinar, prenchendo nome e e-mail

meet.google.com/hkk-mhai-osm

Divulgação do curso DESENVOLVOMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS

Turma 01: início em 23 de julho de 2020

Aulas ao vivo online das 19 as 22h

Aulas gravadas disponíveis em plataforma EAD

Inscrições:

https://cromvallab.com/pagina-inicial/curso-novo-desenvolvimento-de-metodos-cromatograficos-para-desenvolvimento-de-produtos/

ou cromvallab@gmail.com

Investimento: De 1199 reais por 799,00 reais.

Como quantificar impurezas orgânicas e/ou produtos de degradação?

A definição do perfil de IMPUREZAS é a chave para assegurar a segurança, eficácia e qualidade de produtos farmacêuticos.

O perfil de impurezas mudou drasticamente nos últimos anos e se tornou um DESAFIO conhecer apropriadamente esse perfil

Guias, especificações e regulamentações surgiram, cada  vez mais exigentes e detalhadas.

Inicialmente o perfil de impurezas eram baseados em métodos simples, depois em estudos de degradação: o entendimento da estabilidade do fármaco, eficácia relacionada com as impurezas quirais e estereoisômeros foram incluídos, seguidos por métodos para solventes residuais, formas polimorfas e estudos de impurezas genotóxicas.

Tipos gerais de impurezas que podem ser encontradas em produtos farmacêuticos.

Impurezas orgânicas podem aumentar durante o processo de fabricação, devido a interações com excipientes e ativo e devido o armazenamento do insumo farmacêutico ativo (IFA) ou medicamento. As impurezas podem ser conhecidas ou desconhecidas, voláteis ou não voláteis. Em outras épocas as impurezas já foram identificadas e controladas com testes qualitativos como TLC e IR ou titulação. Atualmente, 80% dos fármacos são analisados utilizando técnicas cromatográficas para controlar as impurezas orgânicas.

Evolução das técnicas analíticas empregadas para avaliar impurezas.

O HPLC-PDA/UV, GC, LC MS, GC MS são as principais técnicas empregadas para identificar impurezas com um método analítico validado.

Pureza de pico e balanço de massa nos procedimentos de estudos de degradação forçada são requeridos, para comprovar a quantificação e performance do método. O balanço de massa é o “processo de somar todos os valores de produtos de degradação quantificados no procedimento e verificar o quanto essa soma se aproxima do valor inicial do analito, levando em consideração a margem de precisão analítica do método” . As impurezas acima dos limites de identificação devem ser consideradas na avaliação do perfil de impurezas para o IFA ou produto acabado.

Exemplo de análise para produtos de degradação, resultados de pureza de pico e balanço de massa.

Cada um dos picos não desconsiderados no cromatograma do produto deve ter sua área quantificada. Inicialmente, cada pico pode ser quantificado pela porcentagem que sua área representa em relação à soma de todas as áreas, ou por comparação da área deste pico com o de um padrão do fármaco injetado em concentração menor que na amostra.

MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO

Os  seguintes métodos podem ser usados para a determinação quantitativa de impurezas orgânicas:

a) Calibração externa: este método é usado para os ensaios e para a estimação de impurezas em uma dada amostra, nas quais as impurezas são quantificadas usando os padrões da própria impureza e sem o pico do padrão do IFA. É possível estimar a concentração usando a curva de calibração.

b) Normallização de área: se o RRF de uma impureza conhecida é relacionado com o IFA (isto é, de 0,9 a 1,1),  a normalização de área é uma boa escolha para a quantificação. A recuperação precisa ser estabelecida se musar o fator de resposta.

c) Método de diluição do padrão: se o RRF da impureza são diferentes em relação ao analito, o método de diluição do padrão pode ser escolhido para quantificação. O padrão do IFA deve ser diluído para alcançar valores similares aos limites de impurezas esperadas e os picos de impurezas devem ser quantificados pelo padrão do IFA.

d) Padrão interno: se o procedimento de preparo de amostra envolve diferentes  passos de extração, para evitar erros, um padrão interno pode ser escolhido (normalmente necessário para técnicas de derivatização e métodos bioanalíticos).

Fatores que  podem prejudicar o balanço de massa perfeito: a)Alguns produtos de degradação não são detectados e/ou integrados no cromatograma de resultados – estão abaixo do que o limite de detecção, não são detectáveis pelo tipo de detector, não apresentam interação/retenção pela coluna cromatográfica que está sendo usada, não é compatível com as condições de análise (pH de Fase Móvel, por exemplo) e não é compatível com o próprio preparo da amostra (diluente/técnica de preparo) b)Alguns produtos de degradação podem degradar e não se torna possível analisa-los. Ex: eles podem ser precipitados Alguns produtos podem ser voláteis.

Problemas com a quantificação cromatográfica:

As impurezas ou produtos de degradação podem ser de 2 tipos básicos – conhecidas ou desconhecidas. As conhecidas têm sua estrutura química conhecida e pode ser possível utilizar uma substância química de referência (padrão de mesma estrutura verdadeira) e a quantificação dessas poderá ser realizada por calibração externa.

As impurezas desconhecidas não permitem que se utilize a quantificação com calibração externa utilizando o próprio composto real como referência e neste caso é quantificado por porcentagem de área padronizada no próprio cromatograma (o que é um erro se não estivermos detectando todos os produtos da reação e se os produtos tiverem sensibilidades muito distintas); ou podem ser quantificados empregando o próprio ativo como referência. Neste caso também deve-se esperar que exista um erro grande pois seria necessário uma curva de calibração que cobrisse a faixa de concentração correta e seria necessário garantir que o padrão conseguisse representar o mesmo nível de sinal analítico gerado, sendo proporcional a concentração.

Assim, é muito mais favorável quantificar a redução do pico do ativo (maior precisão e exatidão) do que quantificar no que o ativo pode ter sido convertido (produtos de degradação) e estabelecer qual a concentração real dessas substâncias formadas (menor precisão e exatidão).

Então a pergunta é: como é possível realizar o balanço de massa real se não for possível quantificar todos os produtos de degradação com exatidão?

Discussão presente em nosso curso Produtos Degradação: RDC 53/2015 e Guia Anvisa -Visão Prática e Aplicada e Estabilidade de IFA e Medicamentos: RDC 318/2019 (para inscrições escreva cromvallab@gmail.com).

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