Você conhece a cromatografia convergente e a cromatografia unificada?

O mecanismo básico de qualquer separação cromatográfica é criar condições para que os analitos presentes em uma mistura se movam através do sistema, com velocidades diferentes o suficiente para permitir serem separados, detectados e quantificados.

A primeira regra da fase estacionária é possuir propriedades que retenham e interajam diferentemente pelos analitos enquanto a fase móvel força os analitos a se moverem até a saída do sistema.

Este processo é similar para a cromatografia líquida (LC), cromatografia a gás (GC) e para a cromatografia convergente (CC). A diferença está em como as propriedades da fase móvel interferem na forma que os analitos se separam em cada tipo de sistema cromatográfico.

Cromatógrafo a Gás
Cromatógrafo líqudo
Cromatógrafo convergente (fluido supercrítico).

Em GC, a fase móvel é normalmente um gás inerte e não reativo, tipicamente nitrogênio ou hélio. Nas condições de operação de temperaturas e pressões em GC, a fase móvel não pode solvatar as moléculas do analito ou modificar a superfície da fase estacionária. A fase móvel de CG age como um carregador dos analitos através da coluna. A retenção e separação dos analitos ocorre somente devido a interação das moléculas na fase estacionária.

Esquema de separação para CG, HPLC de FR, HPLC de FN e Cromatografia Convergente.

Em LC, por outro lado, a fase móvel desempenha um papel essencial na otimização da separação, sendo que os analitos , a fase móvel e a fase estacionária participam de equilíbrios que governam a separação. A fase móvel influência na retenção dos analitos, devido a solvatação e também reduzindo a interação e retenção do analito na fase móvel, competindo com a superfície da fase estacionária.

Em cromatografia convergente a tecnologia de separação envolve uso de CO2 comprimido como o principal solvente (fase móvel cromatográfica), em pressões da ordem de 100 a 400 vezes a pressão atmosférica. Muitas vezes o CO2 é misturado com um líquido co-solvente (por exemplo metanol, etanol, isopropanol, acetonitrila) para ajustar as propriedades da fase móvel. Na verdade, a cromatografia convergente (CC) é o nome moderno da cromatografia de fluido supercrítico (SFC).

A SFC foi inventada como uma técnica cromatográfica empregando solventes em condições supercríticas para expandir a capacidade da CG. Para contornar o fato da CG não ser compatível com analitos instáveis termicamente, pesquisadores empregaram pressões elevadas para não necessitar de altas temperaturas. Condições supercríticas foram selecionadas para:

  • aumentar o poder de solvatação de um gás altamente pressurizado
  • evitar condições onde a fase móvel não mais flui como um solvente simples pela variação tanto devido a pressão ou a temperatura ou ambos.

Mais tarde, foi percebido que a variação da densidade do solvente pode modular a força do solvente, que é a principal vantagem de trabalhar com fluido supercrítico. Devido os fluidos serem altamente compressíveis sobre condições supercríticas, mesmo pequenas mudanças na pressão mudam drasticamente a densidade e modificam a retenção do analito. De fato, pode-se criar um gradiente de solvente pela variação de pressão e modular a densidade, eliminando a necessidade de adicionar e variar a proporção de solventes orgânicos para trabalhar com gradientes. Assim, o fluido supercrítico representa a possibilidade de altas eficiências de separação usando um único solvente não tóxico.

Entretanto, tem-se limites pois o CO2 é apolar, mesmo modulando a densidade e para melhorar a separação de moléculas apolares ainda torna-se necessário adicionar solventes mais polares. Isto mudou o rumo do desenvolvimento da SFC, pois ao se introduzir metanol ou outros solventes polares juntamente com o CO2 a separação acaba ocorrendo em condições que não são de fato supercríticas na maior parte do tempo (exemplo: na adição de 60 % de metanol ou mais). Na continuidade deste desenvolvimento se percebeu que a separação já não dependia mais das condições supercríticas e, adicionalmente, os equipamentos se SFC não conseguiam manter a mesma robustez ao trabalhar com CO2 comprimido e obter as mesmas repetitividade e exatidão obtidos em LC ou GC.

Com todas as mudanças, em 2012, a Waters introduziu o Cromatógrafo Convergente de Ultra Performance (UFC²), com significativa alta robustez instrumental.

A palavra “convergente” na Cromatografia Convergente foi utilizada devido a observação de que as tecnologias cromatográficas existentes (LC e GC ) são convertidas em um único sistema. A SFC foi utilizada como “ponte” entre a LC e GC e estender o uso de fase móvel ao redor das condições supercríticas. CC está atualmente cada vez mais sendo usada com co-solventes orgânicos atendendo tanto a região super e subcrítica, expandindo a modulação de densidade de de CO2 anteriormente limitada.

Na prática, além de cobrir um gap entre as aplicações de LC e GC, a CC tem um potencial muito maior do que foi originalmente idealizada.

Alguns pesquisadores defendem este desenvolvimento no que tem sido chamado de Cromatografia Unificada (LC, GC e SFC). De fato, observa-se que o desenvolvimento é amplo e a cromatografia cada vez mais se reafirma como a técnica analítica mais versátil de todos os tempos.

Sistema Nexera UC: conversão de SFC em UHPLC.

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

Cromvallab: cursos e consultoria

ICH Q3D: Análise de Impurezas Elementares em fármacos – uso de ICP-OES, ICP-MS e EDX

O guia harmonizado do ICH para impurezas elementares, ICH Q3D, requer o controle de resíduos de 24 elementos (Metais tóxicos), os quais preocupam devido a suas toxicidades. Ele foi publicado em 2015, mas este requerimento começou a ser aplicado em produtos farmacêuticos novos em Junho de 2016 nos Estados Unidos e Europa e em Abril de 2017 no Japão.

Nos produtos já registrados, essas análises começaram a ser implementadas em janeiro de 2018 os Estados Unidos e em dezembro de 2017 na Europa.

No Brasil poucas empresas começaram a atender essa necessidade, e somente após vigência dos capítulos 232 e 233 da USP (em 2018), essas pesquisas se intensificaram.

As principais técnicas indicadas para análise de impurezas elementares são o plasma indutivamente acoplado com espectrometria de emissão ótica (ICP-OES) e plasma indutivamente acoplado com espectrometria de massas (ICP-MS). Porém, o método alternativo empregando espectrometria de fluorescência de raio-x (EDX) também surge como uma alternativa, conforma método USP <735>.

As impurezas elementares são divididas em classes de acordo com a sua toxicidade e os limites são estabelecidos de acordo com os cálculos de Permitted Daily Exposure (PDE) e análise de risco de acordo com as fontes de contaminações:

  • Classe 1: Elementos As, Cd, Hg, and Pb, são tóxicos para os humanos e devem ser limitados ou ausentes nos medicamentos de consumo humano. A presença desses em medicamentos são tipicamente oriundas de materiais comumente usados (excipientes extraídos).
  • Classe 2: Elementos desta classe são geralmente considerados como toxicantes de rota dependentes. São divididos nas subclasses 2A e 2B
  • Classe 2A: Co, Ni and V. Elementos com relativamente alta probabilidade de ocorrência em medicamentos e então requerem análise de risco de todas as potenciais fontes de impurezas e vias de administração.
  • Classe 2B: Ag, Au, Ir, Os, Pd, Pt, Rh, Ru, Se and Tl. Elementos tem uma probabilidade reduzida de ocorrência em medicamentos relacionados com suas baixas abundâncias e baixo potencial de ser co-isolado com outros materiais. Assim, eles podem ser excluídos da análise de risco a menos que sejam intencionalmente adicionados durante o processo de fabricação do fármaco, excipientes ou outros componentes do produto acabado.
  • Classe 3: Ba, Cr, Cu, Li, Mo, Sb, and Sn. Os elementos dessa classe tem relativamente baixa toxicidade por administração oral (alto PDE, geralmente maior que 500 µg/dia) mas pode ser requerido considerar na análise de risco para via de inalação e parenteral.
  • Outros elementos: Al, B, Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na, W e Zn. Algumas impurezas elementares para as quais o PDE não foi estabelecido ou que possuem baixa toxicidade inerente, mas que podem representar ameaças diferenciadas ao organismo humano merecem atenção. Exemplo: Al – pode comprometer funções renais; Mn e Zn – podem ser prejudiciais no caso de pacientes com problemas hepáticos).

Tabela 1. Exemplos de parâmetros e resultados de validação para impurezas elementares usando EDX com técnica analítica

Tabela 2. Exatidão (ug/g).

Tabela 3. Resultados obtidos por ICP-MS (ug/g).

Tabelas extraídas da Shimadzu Application News No. X271.

Novos tempos, novos desafios. Neste caso, as principais dificuldades são a implementação dessas novas metodologias, os valores de PDE e o atendimento aos níveis necessários.

Caso deseje uma consultoria na área escreva cromvallab@gmail.com

Os métodos abordados aqui são discutidos no curso de Desenvolvimento de Métodos Analíticos para Desenvolvimento de Produtos.

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

WEBINAR GRATUITO: QUALITY BY DESING APLICADO AO DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS

Inscrições direto no chat do webinar, prenchendo nome e e-mail

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Divulgação do curso DESENVOLVOMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS

Turma 01: início em 23 de julho de 2020

Aulas ao vivo online das 19 as 22h

Aulas gravadas disponíveis em plataforma EAD

Inscrições:

https://cromvallab.com/pagina-inicial/curso-novo-desenvolvimento-de-metodos-cromatograficos-para-desenvolvimento-de-produtos/

ou cromvallab@gmail.com

Investimento: De 1199 reais por 799,00 reais.

Como quantificar impurezas orgânicas e/ou produtos de degradação?

A definição do perfil de IMPUREZAS é a chave para assegurar a segurança, eficácia e qualidade de produtos farmacêuticos.

O perfil de impurezas mudou drasticamente nos últimos anos e se tornou um DESAFIO conhecer apropriadamente esse perfil

Guias, especificações e regulamentações surgiram, cada  vez mais exigentes e detalhadas.

Inicialmente o perfil de impurezas eram baseados em métodos simples, depois em estudos de degradação: o entendimento da estabilidade do fármaco, eficácia relacionada com as impurezas quirais e estereoisômeros foram incluídos, seguidos por métodos para solventes residuais, formas polimorfas e estudos de impurezas genotóxicas.

Tipos gerais de impurezas que podem ser encontradas em produtos farmacêuticos.

Impurezas orgânicas podem aumentar durante o processo de fabricação, devido a interações com excipientes e ativo e devido o armazenamento do insumo farmacêutico ativo (IFA) ou medicamento. As impurezas podem ser conhecidas ou desconhecidas, voláteis ou não voláteis. Em outras épocas as impurezas já foram identificadas e controladas com testes qualitativos como TLC e IR ou titulação. Atualmente, 80% dos fármacos são analisados utilizando técnicas cromatográficas para controlar as impurezas orgânicas.

Evolução das técnicas analíticas empregadas para avaliar impurezas.

O HPLC-PDA/UV, GC, LC MS, GC MS são as principais técnicas empregadas para identificar impurezas com um método analítico validado.

Pureza de pico e balanço de massa nos procedimentos de estudos de degradação forçada são requeridos, para comprovar a quantificação e performance do método. O balanço de massa é o “processo de somar todos os valores de produtos de degradação quantificados no procedimento e verificar o quanto essa soma se aproxima do valor inicial do analito, levando em consideração a margem de precisão analítica do método” . As impurezas acima dos limites de identificação devem ser consideradas na avaliação do perfil de impurezas para o IFA ou produto acabado.

Exemplo de análise para produtos de degradação, resultados de pureza de pico e balanço de massa.

Cada um dos picos não desconsiderados no cromatograma do produto deve ter sua área quantificada. Inicialmente, cada pico pode ser quantificado pela porcentagem que sua área representa em relação à soma de todas as áreas, ou por comparação da área deste pico com o de um padrão do fármaco injetado em concentração menor que na amostra.

MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO

Os  seguintes métodos podem ser usados para a determinação quantitativa de impurezas orgânicas:

a) Calibração externa: este método é usado para os ensaios e para a estimação de impurezas em uma dada amostra, nas quais as impurezas são quantificadas usando os padrões da própria impureza e sem o pico do padrão do IFA. É possível estimar a concentração usando a curva de calibração.

b) Normallização de área: se o RRF de uma impureza conhecida é relacionado com o IFA (isto é, de 0,9 a 1,1),  a normalização de área é uma boa escolha para a quantificação. A recuperação precisa ser estabelecida se musar o fator de resposta.

c) Método de diluição do padrão: se o RRF da impureza são diferentes em relação ao analito, o método de diluição do padrão pode ser escolhido para quantificação. O padrão do IFA deve ser diluído para alcançar valores similares aos limites de impurezas esperadas e os picos de impurezas devem ser quantificados pelo padrão do IFA.

d) Padrão interno: se o procedimento de preparo de amostra envolve diferentes  passos de extração, para evitar erros, um padrão interno pode ser escolhido (normalmente necessário para técnicas de derivatização e métodos bioanalíticos).

Fatores que  podem prejudicar o balanço de massa perfeito: a)Alguns produtos de degradação não são detectados e/ou integrados no cromatograma de resultados – estão abaixo do que o limite de detecção, não são detectáveis pelo tipo de detector, não apresentam interação/retenção pela coluna cromatográfica que está sendo usada, não é compatível com as condições de análise (pH de Fase Móvel, por exemplo) e não é compatível com o próprio preparo da amostra (diluente/técnica de preparo) b)Alguns produtos de degradação podem degradar e não se torna possível analisa-los. Ex: eles podem ser precipitados Alguns produtos podem ser voláteis.

Problemas com a quantificação cromatográfica:

As impurezas ou produtos de degradação podem ser de 2 tipos básicos – conhecidas ou desconhecidas. As conhecidas têm sua estrutura química conhecida e pode ser possível utilizar uma substância química de referência (padrão de mesma estrutura verdadeira) e a quantificação dessas poderá ser realizada por calibração externa.

As impurezas desconhecidas não permitem que se utilize a quantificação com calibração externa utilizando o próprio composto real como referência e neste caso é quantificado por porcentagem de área padronizada no próprio cromatograma (o que é um erro se não estivermos detectando todos os produtos da reação e se os produtos tiverem sensibilidades muito distintas); ou podem ser quantificados empregando o próprio ativo como referência. Neste caso também deve-se esperar que exista um erro grande pois seria necessário uma curva de calibração que cobrisse a faixa de concentração correta e seria necessário garantir que o padrão conseguisse representar o mesmo nível de sinal analítico gerado, sendo proporcional a concentração.

Assim, é muito mais favorável quantificar a redução do pico do ativo (maior precisão e exatidão) do que quantificar no que o ativo pode ter sido convertido (produtos de degradação) e estabelecer qual a concentração real dessas substâncias formadas (menor precisão e exatidão).

Então a pergunta é: como é possível realizar o balanço de massa real se não for possível quantificar todos os produtos de degradação com exatidão?

Discussão presente em nosso curso Produtos Degradação: RDC 53/2015 e Guia Anvisa -Visão Prática e Aplicada e Estabilidade de IFA e Medicamentos: RDC 318/2019 (para inscrições escreva cromvallab@gmail.com).

Vamos falar um pouco sobre a técnica HILIC/HPLC?

A cromatografia líquida de alta eficiência utilizando as interações hidrofílicas é uma opção diferente entre a cromatografia de fase reversa e a cromatografia de fase normal. Esta técnica é conhecida como HILIC (cromatografia de interações hidrofílicas) e preenche uma lacuna de aplicações entre a cromatografia iônica, de fase reversa e de fase normal, pois permite a análise de compostos com alta polaridade (logP menor que zero), mas usando fase ainda constituída por água (isto é, aplicável para compostos solúveis em meio aquoso.

Devido a estas características, a HILIC é uma modalidade muito útil para análise de medicamentos antivirais e pode ser utilizada, com vantagens, para acompanhar o desenvolvimento de novos medicamentos antivirais sintetizados utilizando como núcleo central uma base purina (como o aciclovir, sintetizado a partir da guanina).

Métodos cromatográficos com colunas mais polares e fases móveis constituídas de mais de 60% de acetonitrila e água permitem desenvolver e validar métodos satisfatórios e eficientes para acompanhamento de teor, impurezas e estabilidade de antivirais, sendo métodos indicativos de estabilidade, seletivos para atender o perfil de degradação potencial e real desses medicamentos.

Esquema ilustrativo para o processo de separação HILIC que pode incluir interações hidrofílicas do tipo partição, interações eletrostáticas e ligações de hidrogênio.
Exemplo de aplicação da HILIC para desenvolvimento de métodos para antivirais e produtos de degradação.

As vantagens citadas aqui não significam que o HILIC é superior ao HPLC com fase reversa, mas sim que é um ótima opção, e ainda pouco explorada, quando os compostos mais polares apresentam dificuldade de retenção usando um sistema de fase reversa e quando não existem parâmetros otimizáveis para tornar este métodos aplicáveis. Além disso, muitas opções de colunas diferentes estão surgindo como opções comerciais interessantes (inclusive variando o caráter ácido, básico ou neutro das fases estacionárias), o que deve auxiliar a alavancar o uso das técnicas HILIC e aumentar ainda mais a versatilidade da cromatografia líquida como um todo.

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS POR HPLC: USO DE TEMPERATURA

Quarta-feira, dia 20 de maio de 2020 as 18h, faremos uma live no canal do YouTube da Cromvallab para lançar o curso gratuito: DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS POR HPLC USO DE TEMPERATURA.

O curso estará disponível em nossa plataforma EAD e será gratuito para os participantes da live, com direito a certificado.

O assunto é muito interessante! O uso de altas temperaturas no HPLC permite contornar praticamente todos os pontos críticos do desenvolvimento de métodos em cromatografia líquida.

Não percam!

Exemplo de mudança de perfil cromatográfico com o aumento da temperatura.

O QUE É MAIS IMPORTANTE PROFISSIONALMENTE, A EXPERIÊNCIA PRÁTICA DE FATO OU O CONHECIMENTO TEÓRICO?

Após vários anos trabalhando em indústrias e também na interface desta com a área acadêmica, pude me deparar com a frase “preciso adquirir experiência em HPLC” muitas e muitas vezes.

Mas o que de fato importa nesta “experiência” necessária? Comprovar a habilidade que se torna automática em seguir as sequências corretas e chegar ao resultado previamente determinado?

Penso fortemente que não! Experiência operacional com cromatografia não é de fato o diferencial pretendido, uma vez que mesmo quem não cozinha também está apto a seguir uma receita de bolo.

É claro que a parte técnica, o que se aprende no dia a dia real conta e conta muito. Mas não é disso a que me refiro. Me refiro a urgência de considerar que o ensino da prática operacional, sequência de botões e etc realmente pode garantir a tal experiência em HPLC que se almeja. Ela sozinha só permite criar um operador e não de fato um analista.

Discordem de mim, por favor, e argumentem mas a minha resposta para a frase “preciso adquirir experiência em HPLC” é sempre uma pergunta: “mas você sabe o que é HPLC?”

Treinar um analista para executar a sequência correta necessária para a operação, até mesmo dos mais tecnológicos equipamentos, não é o ponto de fato desafiador. Leva-se um tempo para se habituar com a rotina técnica operacional mas isso é treinável de forma prática e quase automática com o uso contínuo. O ponto desafiador e que representa um diferencial para uma equipe de trabalho é ter analistas que conhecem a técnica de acordo com os “porquês” e o que deve ser feito quando o que está no procedimento não funciona. Isto é bem mais difícil de treinar, e, de fato, não é treino, é conhecimento adquirido com estudo e dedicação.

Saber quais os mecanismos de separação envolvidos, como ocorre a interação e a migração diferenciada causada pela disputa fase móvel x fase estacionária, saber distinguir as diferentes opções de fases estacionárias, fases móveis e características físico-químicas envolvidas no processo de separação, associadas com o “como fazer” ´significa de fato o diferencial e permite resolver os desafios do analista que utiliza o HPLC.

Se você, que almeja tanto “adquirir experiência em HPLC” tiver a sorte de encontrar quem lhe transmita anos de vivência associado com conceitos que expliquem os porquês e como, daí sim talvez possa, com a urgência que nos é habitual nos dias de hoje, adquirir a sonhada “prática em HPLC” sem ter que esperar anos para isso… Quem me conhece sabe o quanto eu gosto de falar sobre isso nos meus cursos e treinamentos!

E lembrem-se: um bom curso prático não significa curso que só ensina a operar um equipamento, mas sim um curso que discute como, porque e o que deve ser feito para alcançar os melhores resultados quando os desafios aparecerem. Só a teoria não nos salva, nem tão pouco só a prática operacional é de fato prática.

Um breve histórico sobre o desenvolvimento de colunas e partículas para HPLC/UPLC – comparações com curva de van Deemter

Cursos na CROMVALLab e o Corona vírus

A CROMVALLab, atendendo as orientações do Ministério da Saúde, informa que os cursos terão somente 10 vagas (evitando aglomerações), serão disponibilizados álcool em gel e materiais descartáveis. Além disso, também será possível realizar os cursos a distância, no modelo EAD.
Estamos torcendo que consigamos evitar maiores transtornos e fazendo a nossa parte para que o Corona vírus não prejudique nossas atividades.

Cursos:
21 de março – HPLC Prático
28 de março – Estabilidade de IFA e Medicamentos (RDC 318/2019)
04 de abril – Validação de Métodos Analíticos: RDC 166/2017, ICH e Testes Estatísticos

Inscrições (presenciais e EAD) e informações: cromvallab@gmail.com ou cromvallab.com

Abraços!

Vale a pena migrar de HPLC para UPLC?

Em 2004 a Waters colocou no mercado de cromatógrafos os equipamentos de Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) com a promessa de que haviam muitas vantagens na substituição dos métodos de High Performance Liquid Chromatography (HPLC) pelos métodos de UPLC. Hoje, 16 anos mais tarde, a pergunta a respeito das vantagens da substituição da técnica se torna mais clara e outras empresas também investiram nestes equipamentos e temos mais opções de colunas adaptadas para estas metodologias.

Mais do que só reduzir dimensões e gasto com fases móveis o UPLC mostra uma capacidade elevada de separar picos cromatográficos e alcançar parâmetros de excelência em seus métodos.

Comparação entre resultados obtidos por HPLC e UPLC – destaque para o menor tempo de análise.

Um método desenvolvido por UPLC pode ser 16x mais eficiente do que um método desenvolvido por UPLC. Economiza-se solventes de fase móvel, tempo, as quantidades de amostras também são reduzidas. Porém, o custo do equipamento ainda é significativo maior e as colunas que atendem a esta melhor ultra performance (com partículas de 1,7 um de diâmetro, também chegam a ser 2, a 3 x mais caras).

Comparação de diâmetros de partícula empregadas nas colunas de UPLC – capacidade de picos em 1 min comparáveis as obtidas em 16 min com colunas de 5 um.


Os gradientes desenvolvidos em UPLC são muito mais rápidos e as eficiências também aumentam muito. Assim, se tempo é dinheiro, o maior custo da técnica de UPLC com certeza se paga com a economia real de tempo e melhor desempenho que apresenta.

Venha discutir este e outros assuntos relacionados ao desenvolvimento prático de métodos cromatográficos no curso HPLC Prático: colunas, fases móveis e desenvolvimento. Próxima turma dia 21 de março de 2020, das 8 as 17 h, na CROMVALLab, em Paulínia.
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