O QUE É DISSOLUÇÃO

É o processo pelo qual um fármaco é liberado de sua forma farmacêutica e se torna disponível para ser absorvido pelo organismo.

Já o ensaio de dissolução é um ensaio físico in vitro, onde é possível determinar a quantidade liberada do fármaco no meio de dissolução, quando submetido a condições experimentais controladas e aparelhagem específica, como por exemplo o volume do meio, aparatos, rotação, temperatura e tempo, ou seja, para a realização do ensaio de dissolução é necessário a utilização de um equipamento específico chamado dissolutor (Figura 1), que é constituído por:

– Cubas: local onde o meio de dissolução é adicionado e também onde ocorerá a dissolução;

– Aparatos: I (cestos) e II (pás), com o auxílio de um motor é ajustado a velocidade de rotação dos aparatos gerando, assim, a hidrodinâmica que é responsável pela desintegração e dissolução da forma farmacêutica;

– Revervatório de água: também chamado de banho, local onde a água é aquecida e por troca de calor aquece o meio de dissolução dentro da cuba.

Figura 1: Alguns aparatos de dissolução, ilustração do processo (cubas), Dissolutor.

Qual a importância do ensaio de dissolução para a Indústria Farmacêutica?

O ensaio de dissolução é considerado o ensaio mais importante para uma forma farmacêutica sólida, pois é o ensaio in vitro que mais se assemelha com o comportamento in vivo, uma vez que, para que um fármaco seja absorvido é necessário que ocorra a desintegração e a dissolução e esses dois parâmetros é posssível verificar no teste de dissolução.

Além disso, o teste de dissolução é imprescindível para o desenvolvimento e estabilidade de formulações, avaliação do processo de fabricação, detecção de desvios de fabricação e diminuição do risco da falta de bioequivalência entre lotes, podendo ser utilizada para obter a bioisenção do produto.

Figura 2: A importância dos teste de dissolução e para que ele se aplica.

Se vocês gostariam de saber mais a respeito do ensaio de dissolução, aproveitem os cursos “Fundamentos de Dissolução” e “Desenvolvimento de método de dissolução utilizando Aparatos IV” mininistrado pelo Msc. Rodolfo Duarte, cuja inscrições estão abertas através deste link: https://forms.office.com/Pages/ResponsePage.aspx?id=jOaT0T_lEEambVb_MA_segRnyxMRLYRIsQD-975RnKVUOUZLWlJTMFBKU1pCOEJFQ0pQT1Y1S0w5VS4u

Para mais conteúdos sobre Dissolução, acessem o LinkedIn: https://www.linkedin.com/in/rodolfo-duarte-msc-410518b3/

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Um pouco mais sobre a cromatografia de convergência (CC) – APLICAÇÕES

Autor: Igor M. Santana, M.Sc. , Pesquisador a nível doutorado, Departamento de Química Analítica, Instituto de Química da Unicamp

Em um post anterior (que pode ser lido clicando aqui: https://cromvallab.com/2020/09/12/voce-conhece-a-cromatografia-convergente-e-a-cromatografia-unificada/o aqui), foi falado da cromatografia de convergência (CC) e suas diferenças para as tradicionais cromatografia líquida (LC) e gasosa (GC). Nesse post, detalharemos um pouco mais sobre essa técnica que surgiu no começo dos anos 60, mas não alcançou a mesma popularidade de LC e GC. A CC também pode ser conhecida pelo seu nome popular, cromatografia com fluido supercrítico (ou SFC). Por isso, é preciso primeiro entender o que é um fluido supercrítico e como suas propriedades aplicam-se à cromatografia.

O fluido supercrítico está em uma condição de pressão e temperatura na qual líquido e gás coexistem, mas sem haver uma separação entre eles. Por exemplo, a água em ebulição: é possível ver onde o líquido termina e onde o vapor começa, através da formação de bolhas, condição na qual chamamos de separação de fases. Em um fluido supercrítico, as propriedades do líquido e do gás, como densidade e viscosidade, convergem a tal ponto em que se tornam uma fase só (Figura 1). Em outras palavras, as propriedades de um fluido supercrítico são intermediárias às de um líquido e de um gás, principalmente sua densidade e viscosidade, importantes para processos cromatográficos.

      Figura 1. Transformação do CO2 em um fluido supercrítico (sem a separação de fases líquido-gás) ao aumentar a pressão e temperatura.

      Hoje, o principal fluido usado é o CO2 por apresentar condições críticas (pressão e temperatura) brandas em comparação a outras substâncias. Porém, como o CO2 é uma substância muito apolar, é necessário misturá-lo com modificadores polares (como metanol) para ter força suficiente para eluir compostos mais polares, que costumam ser mais retidos na fase estacionária com essa técnica. A adição de modificadores orgânicos altera as propriedades do fluido, principalmente a temperatura crítica, e parte do processo de separação ocorre em uma condição abaixo dessa temperatura, sendo chamada de subcrítica. No entanto, na prática não há diferença significativa entre as condições supercrítica e subcrítica desde que as propriedades do fluido permaneçam contínuas, ou seja, sem separação de fases (é por isso que a instrumentação em SFC requer um item a mais que um instrumento de HPLC tradicional, chamado de regulador de pressão de retorno ou backpressure regulator, BPR) [1]. Como consequência, o termo “supercrítico” não é mais adequado para designar essa técnica cromatográfica, permanecendo apenas por motivos históricos. A característica mais marcante é a compressibilidade do fluido, ou seja, maior sensibilidade a mudanças de pressão e temperatura em comparação a uma fase puramente líquida. O nome cromatografia de convergência (CC) usado pela Waters é pertinente, pois a fase móvel pode convergir nos estados supercrítico, subcrítico (mais comum) e líquido em uma única corrida.

A principal aplicação da CC tem sido na resolução enantiomérica de fármacos, de forma que é vista como substituta ideal para métodos compendiais que empregam cromatografia líquida em fase normal (NPLC). A NPLC emprega solventes agressivos ao meio ambiente (como derivados de petróleo e solventes clorados), tem equilíbrio lento com a fase estacionária e não tem compatibilidade com espectrometria de massas (MS). Por sua vez, o fluido usado em CC (predominantemente CO2 pressurizado) é ecologicamente mais amigável (não inflamável e não tóxico), além de ser mais barato. Além disso, a viscosidade do fluido é muito menor, o que resulta em corridas de 3 a 5 vezes mais rápidas. Como a maior parte da fase móvel é um gás em pressão ambiente, seu acoplamento com MS é facilitado. Por exemplo, o método USP para análise de tolazamida, um fármaco redutor de glicemia, emprega NPLC com grande consumo de hexano, de origem fóssil. O tempo total de análise chega a 30 minutos, a uma vazão de 1,50 mL/min com uma coluna Agilent Zorbax RX-Sil 4,6 x 250 mm, partículas de 5 µm, gerando um resíduo de 43 mL somente de hexano. Sua substituição por SFC reduz o tempo total de análise para 5,5 minutos com a mesma coluna, mas com uma vazão de 3 mL/min. A Figura 2 apresenta os cromatogramas e o resultado para o system suitability, mostrando que ambos os métodos atendem ao critério USP [2]. No caso de SFC, o consumo total de solvente chegou a 16,5 mL, mas gerou apenas 1,0 mL de resíduo para ser tratado, pois a maior parte da fase móvel (CO2) evapora ao fim da análise. Esse caso mostra a nítida economia de tempo (e financeira), que pode ser obtida também em outros métodos onde NPLC ainda é empregada.

Figura 2. Comparação entre métodos NPLC e SFC para tolazamida com base em critérios USP. Adaptado da referência 2.

Outra aplicação vantajosa da CC é a separação ortogonal em comparação à cromatografia líquida em fase reversa (RPLC). A RPLC é o modo cromatográfico mais empregado em indústrias farmacêuticas, porém, falha em obter boas retenções de compostos polares. Agências regulatórias têm exigido o controle de produtos de degradação de IFAs (possíveis metabólitos), os quais costumam ser mais polares, dificultando a sua quantificação por RPLC, ou com estruturas muito similares, apresentando baixa resolução. Uma alternativa é o uso de NPLC ou de cromatografia por interação hidrofílica (HILIC), técnicas ortogonais à RPLC.

Além das desvantagens já discutidas de NPLC, a HILIC depende de grande quantidade de acetonitrila, um solvente mais caro, além de requerer maior tempo de equilíbrio quando eluições gradientes são empregadas, demandando mais tempo por análise. A retenção de compostos apolares também é menor nesse modo. A CC é uma opção viável a estas técnicas por apresentar comportamento ortogonal: a fase móvel é apolar (ao contrário de RPLC e HILIC), e a fase estacionária pode ser tanto polar (sílica, usada em HILIC) como apolar (C18, usada em RPLC). A aplicação direta dessas características é a possibilidade de se obter perfis cromatográficos complementares com apenas duas corridas (uma em CC e outra em RPLC, por exemplo), permitindo ver o maior número de picos com o menor número de alteração experimental (como pH ou fases estacionárias). No exemplo da Figura 3, realizou-se um estudo de produtos de degradação da ondansetrona (medicamento usado para reduzir efeitos de tratamentos quimioterápicos), porém dois produtos (impurezas E e F, mais polares) não foram retidos em nenhuma condição RPLC [3]. O método empregando CC conseguiu reter as impurezas E e F o bastante para quantificá-las em um intervalo de tempo semelhante. No entanto, o IFA e a impureza A coeluem, embora a detecção com espectrometria de massas consiga selecioná-las individualmente. Note também que as impurezas C e D, que são mais retidas no método RPLC, são compostos menos retidos no método CC, evidenciando a seletividade ortogonal de ambas as técnicas cromatográficas.

Figura 3. Comparação da seletividade ortogonal de RPLC com CC para análise de ondansetrona e seus produtos de degradação. Adaptado da referência 3.

Embora a CC seja bem estabelecida em indústrias farmacêuticas, ainda é nítida a resistência que existe no Brasil em introduzir essa técnica no rol analítico. Talvez os principais embargos sejam a aquisição inicial (mais caro que instrumentos UPLC) e a necessidade de mais treinamentos por tratar-se de um modo cromatográfico não convencional (porém, na prática, o usuário de HPLC logo percebe que a operação é similar). Apesar do custo inicial, a alta produtividade e baixa geração de resíduos, além de propriedades complementares à RPLC, tornam a CC economicamente viável a longo prazo. Ainda, essa técnica é complementar a muitos outros modos de HPLC a partir de modificações simples na fase móvel (enquanto as características de outros modos cromatográficos são drasticamente distintas, como RPLC e NPLC, dificultando análises ortogonais). A Figura 4 mostra um resumo simplificado dessa complementaridade [4].

Figura 4. Comparação entre SFC (ou CC) e diferentes modos de cromatografia líquida. A CC é uma opção complementar interessante à LC. Adaptado da referência 4.

Autor: Igor M. Santana, M.Sc.

Pesquisador a nível doutorado

Departamento de Química Analítica

Instituto de Química da Unicamp

Contato: http://lattes.cnpq.br/0702244403546739

Referências

  1. Terry A. Berger, “The past, the present and the future (?) of analytical supercritical fluid chromatography – a 2018 perspective”, Chromatography Today (2018), pp 4-8 (disponível em: https://www.chromatographytoday.com/article/supercritical-fluid-sfcgreen-chromatography/45/sfc-solutions-inc/the-past-present-and-future-of-analytical-supercritical-fluid-chromatography-ndash-a-2018-perspective/2428). Acessado em 01 de fevereiro de 2021.

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System Suitability ou Adequação do Sistema: você sabe tudo a respeito?

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

Assunto discutido nos Cursos:

  • Validação de Métodos Analíticos: RDC 166/2017, ICH Q2 e Testes Estatísticos
  • Operação de HPLC do zero ao 100%
  • HPLC Prático: fases móveis, colunas e desenvolvimento

Dúvidas?

Escreva cromvallab@gmail.com

HPLC Troubleshooting: os mais comuns, as principais causas e as melhores soluções

Dra Glaucia Maria F. Pinto

O que são troubleshooting?

Picos bifurcados ou partidos: causas

Picos bifurcados ou partidos: soluções

Picos assimétricos

Variação da linha de base

Variação no tempo de retenção: aumento de tR

Variação no tempo de retenção: diminuição de tR

Variação no tempo de retenção: flutuações de tR

Picos fantasmas

Picos negativos

Dúvidas?

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Conheça nossos cursos online e presenciais ou faça um treinamento individual.

Existem segredos para processar e integrar picos cromatográficos?

A cromatografia, e principalmente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), está presente no dia a dia de vários laboratórios e analistas. Ao mesmo tempo poderosa, versátil, flexível e complexa!

Dominar a rotina básica de aquisição de dados cromatográficos é relativamente simples, porém, mesmo os mais experientes analistas sabem que o HPLC também pode ser uma “caixinha de surpresas” e de novos desafios diários relacionados com desenvolvimento de métodos e troubleshooting.

Vencidos os possíveis empecilhos para iniciar uma aquisição de dados, a etapa mais importante e trabalhosa se concentra em estabelecer o melhor processamento dos resultados e a melhor integração de picos cromatográficos, pois o tipo de integração irá impactar no resultados real a ser obtido na análise cromatográfica.

Obviamente, quanto melhor for realizado o desenvolvimento do método de separação em si, isto é, quanto melhor estabelecidos estiverem os parâmetros de separação das substâncias presentes na mistura, mais rápido e assertiva será a integração dos picos. Se o método estiver permitindo obter picos bem separados, de área e altura adequados em relação ao ruído, mais simples será a integração (dependendo apenas da determinação dos melhores valores de threshold e peak width). A Figura 1 exemplifica como a escolha correta dos valores de peak width e threshold (também conhecido como slope sensitivity) são importantes. Lembre-se também que o valor de peak width medido para o menor pico do cromatograma deve ser utilizado para definir a taxa de aquisição de pontos, na aquisição de dados (mantendo o valor de 15 a 20 pontos por pico como um valor ideal).

Figura 1. Ilustração da importância da escolha dos valores adequados de peak width e threshold. Note que com valores muito altos ou muito reduzidos os picos são integrados de forma errada ou não são detectados.

A Figura 2 abaixo ilustra a separação de picos cromatográficos:

  • A primeira ilustração representa uma separação excessiva entre as substâncias, o que acarretará um tempo de análise maior que o necessário
  • A segunda ilustração representa uma separação ideal, com resolução adequada
  • A terceira ilustração representa uma separação não adequada, com picos com pouco separação, co-eluindo e mantendo uma zona de mistura entre os dois compostos que podem ser identificados. Estes picos são chamados de picos fundidos e a maior variação de resultados, devido a diferentes possibilidades de integração, ocorrem com esta categoria de picos.
  • A quarta ilustração não pode ser aceita, pois a co-eluição é praticamente completa, com uma zona de mistura praticamente completa entre os compostos.
Figura 2. Ilustração demonstrando a separação de picos desejada.

E quais são as possibilidades de métodos de integração de picos fundidos, como os ilustrados na Figura 2?

A Figura 3 mostra as principais opções de tipos de integração de picos fundidos.

Figura 3. Principais tipos de integração.

A escolha da melhor integração depende de algumas características e objetivos, mas deve-se considerar que é imprescindível que tanto padrão como amostras sejam processados com o mesmo método para reduzir os erros dessas integrações de picos fundidos, que já são mais sujeitos a erros e variações.

A Figura 4 ilustra um exemplo do poder de ajuste que o algoritmo ApexTrack possui.

Figura 4. Exemplos da habilidade de integração que o algoritmo ApexTrack possui.

A Figura 5 apresenta um exemplo do uso do i-PeakFinder, do LabSolution (Shimadzu), completamente automatizado.

Figura 5. Exemplo de integrações automáticas obtidas pelo algoritmo i-Peak Finder do LabSolution (Shimadzu).

O CDS Chromeleon, da Thermofisher, também possui ferramentas para auxiliar na tarefa de integrar picos adequadamente. O algoritmo Cobra e o assistente de integração chamado SmartPeaks são responsáveis pelo auxílio. A Figura 6 demonstra a funcionalidade dessas ferramentas.

Figura 6. Opções de integração do Assistente SmartPeaks.

O artigo disponível no link: Integration Errors in Chromatographic Analysis, Part I: Peaks of Approximately Equal Size (chromatographyonline.com) discute, com valores experimentais obtidos, os vários tipos de erros encontrados utilizando as diferentes integrações de picos, em diferentes proporções de áreas entre picos com pequena resolução.

De forma geral, os erros de integração são praticamente ausentes com resoluções de 2,0 ou mais. Quando as integrações são similares em resultados obtidos, o método de drop integration será então o mais conveniente.

Para resoluções entre 1,5 e 1,0, tanto o método drop ou Gaussian Skim produzem os menores erros se os 2 picos vizinhos tiverem aproximadamente o mesmo tamanho (o pico menor pode ser no máximo 5% menor apenas). O método de valley to valley conduz aos maiores erros negativos, principalmente para pequenos picos. O método exponential skim pode ser inválido para estes casos e conduz a erros negativos significantes para sholder peaks (ombros). Em geral, nesta situação, as medidas de altura levarão a erros menores do que as medidas de áreas. Portanto, o drop method usando altura pode ser a melhor escolha. Uma integração com método Gaussian Skim também pode ser uma escolha aceitável, entretanto, este ainda é um método relativamente mais novo e vários software ainda estão se adaptando.

Assim, como conclusão final, retornamos a Figura 2, pois para reduzirmos os erros de integração, de fato, deve-se priorizar métodos com resolução maior que 2,0. No caso de picos com tamanhos similares é possível aceitar resoluções da ordem de 1,5 e com escolhas de métodos de integração melhores ainda encontrar erros de magnitude aceitável. Porém, resoluções da ordem de 1,0 devem ser evitadas pois o aumento nos erros de integração são significativamente maiores, mesmos com os melhores métodos de integração.

Veja a Figura 7 como exemplo/ilustração das diferenças de métodos de integração em diferentes proporções de tamanho de picos.

Figura 7. Com resoluções abaixo de 1,5 a escolha do método de integração de picos adjacentes deve ser cautelosa, levando em consideração a diferença de tamanho dos picos.

Espero que tenham gostado do post, lembrando que uma discussão sobre o assunto será abordada em nossa Live do dia 22 de julho de 2021 (no canal da Cromvallab no Youtube) e o vídeo ficará disponível.

Observações:

  1. Este assunto é parte integrante do nosso Curso Dominando os Principais CDS Empower e OpenLab e teremos uma aula adicional com aprofundamento e discussão dos algoritmos tradicionais de integração e ApexTrack em breve
  2. No curso Operação de HPLC: do zero ao 100% o processamento e integração de picos cromatográficos são discutidos e exemplificados na prática, utilizando o OpenLab e Empower.

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Abraços!!!

Dra. Glaaucia Maria F. Pinto

O que são CDS´s? Eu preciso conhecê-los?

CDS é a sigla para Chromatography Data System, isto é, são softwares necessários para a aquisição de dados cromatográficos, realizando o controle dos módulos do sistema e o também o controle das condições do método cromatográfico. Além disso, esses softwares são necessários para processar os dados adquiridos, permitindo, resumidamente:

  • integrar os picos cromatográficos, fornecendo o tempo de retenção, área e altura do pico, largura do pico e outros parâmetros importantes (como parâmetros cromatográficos de adequação de sistema – eficiência, resolução, assimetria ou tailing factor, seletividade
  • identificar os picos cromatográficos (sem o acoplamento com o espectrômetro de massa a substância é identificada apenas pela concordância entre o tempo de retenção da mesma substância injetada como padrão em relação ao tempo de retenção da substância na amostra)
Picos cromatográficos integrados e identificados após a aquisição de dados cromatográficos.
  • realizar a quantificação da substância, atendendo o procedimento da calibração com padrões para posterior quantificação da amostra (a substância também pode ser quantificada com a técnica de porcentagem de área em relação a área total, sem uso de calibração interna, externa ou de adição de padrão, mas este procedimento tem utilidades restritas)
Ilustração exemplificando a obtenção de uma curva de calibração externa para permitir a quantificação de substâncias.
  • dependendo do detector, outras opções importantes de processamento estarão disponíveis, como a obtenção de espectros de absorção no ultravioleta (e o importante cálculo da pureza do pico). Neste caso o detector deve ser um DAD ou PDA (detector de arranjo de diodos). Também é possível obter o espectro de massa, para investigação e caracterização ou confirmação de estruturas químicas, com o acoplamento com um espectrômetro de massas.
Ilustração para obtenção de espectros de absorção UV de cada pico cromatográfico
Ilustração de cálculo de pureza de pico, utilizando o conceito de homogeneidade espectral.
Exemplo de cálculo de parâmetro de system suitability (adequação de sistema).

Cada marca de sistema cromatográfico tem, em geral, um CDS, porém, algusn CDS´s se tornaram mais interessantes a ponto de serem empregados com equipamentos de fabricantes diferentes. Alguns dos principais CDS´s estão abaixo e seus fornecedores/detentores de licença de comercialização também:

  • Empower – Waters
  • OpenLab – Agilent (Ezchrom também é uma opção)
  • LabSolution – Shimadzu
  • Thermo/Dionex – Chromeleon
  • Kauner – Clarity Chrom

Existem também CDS que podem ser utilizados em qualquer equipamento e são independentes dos fabricantes de sistemas cromatográficos.

Entre todas as opções, os dois softwares que mais se destacam são o Empower e o OpenLab por estarem presentes em maior quantidade de equipamentos, serem mais conhecidos e abrangentes. Destes dois, pode-se considerar o Empower mais versátil, possibilitando muitas customizações de processamento e de relatórios, mas isso o torna mais complicado de ser “dominado” e entendido em amplitude.

A cromatografia é a técnica mais utilizada e cobrada para atuação profissional em diferentes áreas laboratoriais e industriais e os CDS são a “alma” da execução da análise cromatográfica!

Sem dominá-los torna-se impossível alcançar a excelência necessária para a análise cromatográfica. Sim, precisamos nos especializar no uso dos software para aquisição e processamento de dados cromatográficos.

Tem interesse? Aproveite! Teremos um curso prático presencial dia 26 de junho de 2021. Este curso tem vídeo aulas em plataforma EAD (disponível por 180 dias), apostila, material adicional e certificado. A aula prática presencial será um complemento interessante.

Qualquer dúvida escreva: cromvallab@gmail.com

Abraços

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

E se os dados forem heterocedásticos?

O termo homocedasticidade ficou conhecido com o advento dos atuais requisitos de validação de métodos analíticos, nos quais torna-se necessário verificar e comprovar a homocedasticidade dos dados (dentro dos testes de linearidade).

A ideia é garantir que no intervalo de concentração da faixa de trabalho, os diferentes níveis de concentração apresentam a mesma variância (HOMO= mesma, CEDASTICIDADE= qualidade de cedástico – relativo a variância). Se comprovada a homocedasticidade podemos adotar o modelo de mínimos múltiplos quadrados ordinários (MMQO) para o ajuste dos dados, sendo este modelo mais simples para obtenção de dados de regressão e demais parâmetros da linearidade.

Para verificar e comprovar a homocedasticidade torna-se necessário aplicar testes estatísticos, como:

  • Teste de Cochran (questionável devido a quantidade reduzida de replicatas – O teste de Cochran compara as variâncias de cada ponto da curva de calibração, mas, em geral, temos poucas réplicas de cada ponto para calcularmos as variâncias, portanto o teste de Cochran pode não permitir uma avaliação apropriada para a homocedasticidade no contexto da linearidade
  • Teste Breuch-Pagan (baseado no teste multiplicador de Lagrange) – mais robusto

  • Teste de Goldfeld-Quandt (entre as limitações deste teste está a exigência de que a amostra seja relativamente grande).
  • Teste de Brown-Forsythe (também utilizado como Levene) é utilizado para o teste de igualdade de variâncias, porém em certos casos utilizamos para testar a homoscedasticidade dos resíduos no caso de uma variável explicativa. Este teste considerara a mediana ou 10 % da tri-média (mais robustas), como alternativa para a média no cálculo dos desvios absolutos, sendo menos sensível a desvios de normalidade. Levene propôs uma estatística para dados balanceados, que foi generalizada posteriormente para dados desbalanceados à partir de uma ANOVA (1 fator) entre os grupos, em que cada observação foi substituída pelo seu desvio absoluto da sua média do grupo.

Na execução destes testes devemos realizar a verificação de testes de hipóteses:

Vale ressaltar que a ausência de homoscedasticidade é chamada de heteroscedasticidade. Com isso, testamos as hipóteses: 

Teste de hipóteses avaliada com 95% de intervalo de confiança (nível de significância de 5%).

Hipótese Nula: H0

Hipótese H1 (alternativa): H1 

Se o teste estatístico confirmar que não existe evidência para rejeitar a H0, consideramos os dados homocedásticos e continuamos a executar verificações para confirmação (gráfico de resíduos versus valores ajustados, testes de normalidade de resíduos – por exemplo: Kolmogorov-SmirnovAnderson-DarlingShapiro-Wilk e Ryan-Joiner., gráfico de normalidade).

Exemplo de gráficos de resíduos.
Gráfico de resíduos com evidências de homocedasticidade e de heterocedasticidade.
Histograma e gráfico de normalidade para confirmação de homocedasticidade

Mas e se verificarmos que os dados são HETEROCEDÁSTICOS, como devemos proceder?

Primeiro, esclarecendo, na validação analítica desejamos os dados sejam homocedásticos pois isso significa que dentro da faixa de trabalho verificada podemos esperar que a quantificação possa ser realizada pela regressão linear convencional (isto inclui que é possível usar o método de ponto único, comum em laboratórios farmacêuticos, mas é necessário confirmar que o coeficiente linear é estatisticamente zero).

Se a homocedasticidade não for válida podemos listar algumas consequências:

  • Os erros padrões dos estimadores (coeficientes angular e linear), obtidos pelo Método dos Mínimos Quadrados, são incorretos e portanto a inferência estatística não é válida.
  • Não podemos mais dizer que os Estimadores de Mínimos Quadrados são os melhores estimadores de mínima variância para o coeficiente angular, embora ainda possam ser não viciados.

Assim, se a hipótese de homocedasticidade for rejeitada, para contornar a falha na suposição do modelo de regressão linear, devemos empregar o Modelo de Mínimos Múltiplos Quadrados Ponderados para determinar os estimadores (coeficientes de regressão). A ponderação é necessária pois a heterocedasticidade significa que temos “pesos” diferentes influenciando diferentemente os erros em níveis de concentração dentro da faixa linear do método.

Gráfico evidenciando níveis crescentes de erros para cada nível de concentração, ponderados para atingir a linearidade.

Para obter os estimadores de mínimos quadrados ponderados, no qual devemos considerar que cada uma das n observações podem não gerar a mesma variabilidade nos resíduos, determinamos o peso que cada observação terá sobre os estimadores, utilizamos a ideia de que o peso atribuído a uma observação é inversamente proporcional a variância do resíduo relacionado a ela, em outras palavras, consideramos que as observações que causam maior variabilidade nos resíduos têm menor confiabilidade em termos de inferência para os parâmetros da função de regressão. De maneira análoga, as observações com menor variância são mais confiáveis. Na prática, temos diversas fomas de considerarmos os pesos, caso tenhamos informação de que a variância é diretamente proporcional à variável independente (X), podemos tomar como peso 1/x. 

Assim, no caso de réplicas ou quase réplicas o peso de cada ponto é calculado como o inverso da variância (em geral usamos a variância amostral).

Desta forma, no Modelo de Mínimos Quadrados Ponderados o fator de ponderação deve ser considerado no cálculo dos coeficientes do modelo (exemplo abaixo para o coeficiente angular) e para os demais testes (exemplo para parâmetros de tabela ANOVA).

Cálculo para o coeficiente angular de regressão no MMQP.
Tabela com a descritiva dos cálculos de ANOVA no caso de MMQP.

Algumas observações importantes sobre MMQP

A regressão ponderada é um método que pode ser usado quando a suposição de mínimos quadrados da variância da constante nos resíduos é violada. Com o peso correto, este procedimento minimiza a soma dos resíduos quadrados ponderados para produzir resíduos padronizados com uma variância constante (homoscedasticidade). A regressão ponderada não é uma solução apropriada quando a heteroscedasticidade é causada por uma variável omitida (isto é, quando os dados dependem de outro fator não identificado no modelo).

Como escolher o peso a ser usado ?

Determinar o peso correto a ser usado pode ser uma tarefa desafiadora. O peso ideal é o valor inverso da variância do erro ( ver fórmula descrita acima). Entretanto, isso geralmente não é fácil de ser de fato calculado, sendo as vezes necessário usar outras estratégias. Algumas opções para determinar os pesos:

  • O inverso de um preditor ou preditor ao quadrado se a variância é proporcional a um preditor. Use a experiência combinada com a tentativa e erro para determinar o que funciona.
  • Valores baseados em teoria, literatura ou pesquisa anterior.

Normalmente observações com pequenas variâncias devem ter pesos relativamente grandes e observações com grandes variâncias devem ter pesos relativamente pequenos.

Exemplo:

Suponha que seu modelo de regressão prediz o número anual de acidentes de trânsito em diferentes cidades. Como as cidades mais populosas tendem a ter mais acidentes, os resíduos para cidades maiores também tendem a ser maiores. Uma abordagem para resolver isso é usar o valor inverso da população de cada cidade para determinar o peso.

Em softwares estatísticos, como o Minitab, é possível obter o gráfico de linhas ajustado para regressão linear ponderada. Neste caso, além das variáveis x e y em diferentes colunas, torna-se necessário também organizar uma terceira coluna, com valores de pesos. O gráfico a ser usado é o de dispersão, porém Y ajustado leva em consideração os valores de peso de ponderação.

No Action Stat também é possível realizar o ajuste pelo modelo de regressão ponderado. A Figura abaixo apresenta um comparativo de regressão realizada sem ponderação, mas evidenciando a heterocedasticidade e o gráfico traçado com os pesos ajustados, no modelo de regressão com ponderação. No Action Stat o peso é efetivamente calculado como inverso da variância em cada nível de concentração.

Gráfico no qual se percebe que em concentrações maiores a variância é maior.
Gráfico obtido ajustando os dados de acordo com a regressão ponderada, utilizando pesos e corrigindo as variâncias.

Para um exemplo completo da regressão ponderada acesse: 1.11.2 – Estimação dos parâmetros do modelo – Análise de Regressão | Portal Action

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Dra. Glaucia Maria F. Pinto

Como devemos calcular o volume de injeção máximo a ser utilizado em colunas de HPLC e UHPLC?

Devemos nos preocupar com o volume de amostra  a ser injetado e também com a massa de soluto por massa de fase estacionária a ser utilizado no HPLC.

Estes parâmetros devem ser definidos de acordo com as características da coluna a ser empregada no método de análise.

Sobrecarga de amostra na coluna (2 mg/g de fase) resulta em decréscimo de eficiência, decréscimo de retenção e aumento de cauda, mas em geral é muito difícil conhecer a massa de fase estacionária em colunas analíticas de HPLC e a tendência será sempre trabalhar com amostras bem diluídas.

Assim, volumes de injeção ótimos são diretamente relacionados com o volume da coluna, que deve ser calculada pela área transversal e comprimento da coluna:

Ilustração esquematizando como calcular o volume da coluna cromatográfica a partir de seu diâmetro e comprimento.

Para obter as melhores resoluções e eficiências devemos trabalhar com volumes ótimos de injeção de amostra.

A Figura 1 exemplifica o efeito na qualidade do cromatograma quando se trabalha com volumes excessivos de amostra.

Figura 1a e 1b. Comparativos do efeito de redução no volume de injeção de amostra permitindo obter melhores eficiências, resoluções e reduzindo a assimetria do pico cromatográfico.

O volume máximo de amostra depende: área superficial do suporte, % de recobrimento, fator de retenção dos picos, resolução, volume da coluna;

Volume máximo de injeção deve ser < 1% do  volume interno da coluna vazia.

No caso de uma coluna de 2,1 mm x 5 cm:

V= π.r².L= π.(2,1/2)².50= 173 mm³ volume da coluna

V max= 0,01×173= 1,7 mm³= 1,7 µL

O volume Ideal de injeção versus dimensão da coluna

Nós podemos estimar o volume de injeção apenas com as dimensões da coluna, considerando o mesmo material de empacotamento. Nesta aproximação o diâmetro da coluna é o fator limitante.

Veja a tabela abaixo com os volumes de injeção típicos em função do diâmetro da coluna.

Diâmetro da ColunaVolume (µL)
2,1 mm (30 -100 mm comprimento)1-3
3,0-3,2 mm (50-150 mm comprimento)2-12
4,6 mm (50-250 mm comprimento)8-40
10 mm (50-250 mm comprimento)40-100
21,2 mm (50-250 mm comprimento)150-300
30 mm (50-250 mm comprimento)300-700
50 mm (50-250 mm comprimento)1000-2000

Volumes de injeção grandes podem ser aceitáveis se os picos são ainda simétricos (a vantagem é permitir melhores sensibilidades)

Compostos que eluem mais rápido irão exibir alargamento se o volume for muito alto.

Se o solvente na sua amostra é mais forte do que a fase móvel será necessário usar um volume de injeção menor.

Por outro lado, se o solvente de sua amostra for mais fraco do que a fase móvel, você poderá usar um volume maior de injeção.

  • Se a amostra for preparada com solvente mais forte que a FM diminui-se a eficiência e o fator de retenção;
  • Sempre que possível deve-se preparar a amostra em FM ou em solvente mais fraco;
  • Exemplo: FM com 30% de metanol, amostra deve ser dissolvida em no máximo 30% de metanol. 30% de acetonitrila não é adequado

Para maiores detalhes sobre força de fase móvel veja o post: Vamos falar sobre fase móvel de HPLC e força cromatográfica no desenvolvimento de métodos? – CROMVAL Lab – Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão

Porque vale a pena reduzir as dimensões das colunas (comprimento e diâmetro) e tamanhos de partículas?

Principalmente porque a melhor resolução e eficiência obtidas permitem reduzir os tempos de análise e economizar fase móvel também.

O comparativo abaixo foi calculado utilizando uma ferramenta disponibilizada pela Sigma Aldrich. Na simulação se evidencia a economia de tempo e solvente de acordo com a redução de comprimento (de 15 para 5 cm), diâmetro de coluna (de 4,6 para 2,1 mm) e tamanho de partícula (de 5 para 3 µm) e a correspondente redução no volume de injeção (de 20 para 1,4 µL).

Ferramenta da Sigma Aldrich que permite calcular os respectivos volumes de injeção, vazão de fase móvel e outros ajustes de acordo com a mudança de dimensões da coluna cromatográfica e partícula de fase estacionária, evidenciando a economia de tempo de análise e solvente
(https://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/method-transfer-calculator.html)

Portanto, na transferência de métodos de HPLC para UHPLC, utilizando colunas de menores diâmetros e comprimentos deve-se lembrar de calcular os respectivos volumes de injeção adequados, para permitir a obtenção dos melhores resultados e o volume de injeção acaba sendo também importante no desenvolvimento de métodos na tentativa de alcançar as melhores performances.

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Dra. Glaucia Maria Ferreira Pinto

Vamos falar sobre fase móvel de HPLC e força cromatográfica no desenvolvimento de métodos?

A importância da Fase Móvel (FM) no processo de separação pode ser comprovada através da análise da equação geral de resolução, Rs, na qual dois dos três parâmetros cromatográficos envolvidos (número de pratos ou eficiência, N, o fator de retenção, k, e o fator de seletividade (separação), α, são fortemente influenciados pela FM.

Fórmula de resolução cromatográfica mostrando a influência da eficiência, seletividade e fator de retenção.

Dessa forma, a seleção de uma FM para uma dada separação é extremamente relevante.

A força cromatográfica mede a capacidade da FM em interagir com os componentes da amostra. Essa interação pode ser por meio de forças de Van der Walls (dispersivas ou de London e as dipolo-dipolo de Keesom e Debye), além de ligações de hidrogênio ou forças dielétricas.

Todos esses tipos de interação podem ser agrupados no parâmetro polaridade do solvente – denominada série eluotrópica. A série eluotrópica é organizada de acordo com a polaridade e permite escolher o melhor solvente que será mais competitivo em relação a característica da fase estacionária. Se a fase estacionária for apolar o solvente mais forte será o mais apolar, se a fase estacionária for polar o solvente mais forte será o mais polar. A mistura de 2 ou mais solventes irá permitir controlar a força resultante da fase móvel.

Tabela de força de eluição de solventes, indicando a ordem de polaridade, e comprimento de onda de corte no UV,

Quando pensamos no emprego de certo solvente em um tipo específico de cromatografia, isto é, de fase reversa ou normal, temos a classificação do fator força peso do solvente (S) para definir a escolha do solvente sem relação a nossa necessidade de “força” necessária em uma dada separação. A Tabela a seguir fornece a polaridade do solvente em relação à cromatografia de partição em fase reversa e normal.

Tabela de força peso considerando fase reversa e fase normal.

Observando o valor de força peso, verificamos que é possível trabalhar com uma porcentagem maior de metanol do que de acetonitrila, para obter a mesma força cromatográfica e uma porcentagem menor de THF para obter essa força (considerando uma fase móvel com mistura binária solvente/água).


Nomograma comparando a proporção necessária para obter aproximadamente a mesma força considerando acetonitrila, metanol e tetrahidrofurano (THF).

O Nomograma acima mostra as % em volume de solvente tendo a mesma força eluente. Uma linha vertical intercepta cada linha de solvente no mesmo valor de força eluente.

A retenção de um componente é controlada pela força do solvente. Solventes fortes diminuem a retenção e solventes fracos aumentam a retenção.

A força cromatográfica da FM adequada para uma separação é selecionada através da análise do fator de retenção, k.

Um valor de k baixo significa pouca interação dos solutos com a fase estacionária. Por outro lado, um valor de k elevado implica forte interação entre o soluto e a FE. Nenhum extremo é recomendado, seja por fornecerem separações pouco eficientes seja por implicar em tempos de análises longos, com alargamento dos picos. O intervalo ideal do fator de retenção é 1 ≤ k ≤ 10; entretanto, para análises de múltiplos componentes, também se aceita 0,5 ≤ k ≤ 20.

A força cromatográfica ótima para uma separação é, em geral, selecionada empiricamente por tentativa e erro, como exemplificado abaixo. Porém, atualmente, muitos empregam o QbD para uma abordagem mais sistemática de otimização de FM e método cromatográfico.

Em geral, inicia-se a separação da amostra usando-se uma fase móvel de força cromatográfica elevada, de modo que todos os componentes eluam com tempo de retenção semelhante ao de um composto não retido, tM (t0).

A seguir, sucessivamente, vai-se diminuindo a força cromatográfica da FM até conseguir que o valor de k de todos os componentes esteja compreendido no intervalo ideal.

Exemplos:

Vemos na figura a diminuição da força cromatográfica favorecendo o aumento do fator de retenção (K) e permitindo aumentar a resolução entre os picos (Rs).
Na figura vemos o primeiro cromatograma obtido com uma FM de elevada força cromatográfica e não ocorre a separação. As demais figuras ilustram diferentes tentativas de ajustar a força, reduzindo-a e utilizando diferentes solventes na tentativa de obter uma separação ideal de todos os picos (considerando somente eluição isocrática).
Figura ilustrando o esquema de aumento de força de acordo com a polaridade, para a eluição por fase reversa e para fase normal.
Exemplo de ajuste de força cromatográfica devido ajuste na proporção de solvente orgânico e do tipo de solvente. O último cromatograma mostra uma mistura ternária permitindo obter a melhor resolução entre todos os picos, conciliando seletividade e força dos solventes.

Quando nenhuma possibilidade de ajuste de solventes de fase móvel, considerando eluição isocrática, funciona para obter a resolução ideal entre todos os picos, torna-se necessário considerar o uso do gradiente se entre os compostos existem os de baixa afinidade pela fase estacionária e também outros de grande afinidade pela fase estacionária. Além disso, por vezes, a mudança de seletividade da coluna poderá ser a saída mais adequada.

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Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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