Na cromatografia a Gás, um dos fatores mais importantes é garantir o uso de um gás inerte, puríssimo e compatível com o detector.
Não são muitas as opções (hidrogênio, hélio, nitrogênio, metano e argônio), e, geralmente, na prática optamos por nitrogênio e hélio. Mas como devemos escolher?
Além do uso do gás como substituinte da fase móvel, como gás de arraste, também é importante considerar o tipo e vazão do gás usado como Make up (make up gas) no detector. O uso adequado deste reduz o alargamento de banda e pode aumentar a sensibilidade.
Veja abaixo algumas considerações a respeito dos gases para a boa performance de operação do cromatógrafo à Gás.
Para esclarecer outras dúvidas ou realizar um treinamento em CG escreva: cromvallab@gmail.com
Apesar de todos os cuidados, eventualmente, aquela análise que estava adequada no dia anterior pode apresentar, no dia seguinte, picos deformados, com alteração do tempo de retenção, problemas de quantificação e etc e isso pode ocorrer devido a contaminações e retenções de substâncias da matriz da amostra (ou impurezas da fase móvel e aditivos) na fase estacionária da coluna.
Uma coluna pode voltar a apresentar seus resultados ótimos se executada uma limpeza e regeneração adequada e saber realizar este processo é importantíssimo!
Veja abaixo algumas dicas para livrar a sua coluna de contaminantes e retenções indesejadas. Ela pode durar muito mais!
Gostou das dicas? Quer saber mais a respeito de cromatografia e HPLC?
Todos os consumíveis de HPLC/CG são de grande relevância e podem impactar o resultado de nossa análise de forma positiva ou negativa.
Até mesmo o septo do vial que armazena e permite a injeção automatizada no sistema cromatográfico deve ser escolhido levando-se em consideração a melhor opção para atingir o resultado esperado: compatibilidade com os solventes, inercia química e capacidade de resselar são algumas das característica importantes.
O IDL começou a ser utilizado para determinar a sensibilidade de equipamentos cromatográficos cada vez mais sensíveis, como GC-MS e LC-MS e já representa uma ótima alternativa para verificação de sensibilidade e limite de detecção (LD) dos métodos cromatográficos. Isento da variabilidade e manipulação que a razão sinal ruído apresenta, o IDL merece ser testado e avaliado.
Quer saber mais?
Veja os slides abaixo:
Já conhecia este cálculo?
Gostou do assunto?
Deixe seu comentário!
E venha fazer um curso conosco sobre cromatografia, HPLC, CG, Validação, Estabilidade, Produtos de Degradação e outros…
É o processo pelo qual um fármaco é liberado de sua forma farmacêutica e se torna disponível para ser absorvido pelo organismo.
Já o ensaio de dissolução é um ensaio físico in vitro, onde é possível determinar a quantidade liberada do fármaco no meio de dissolução, quando submetido a condições experimentais controladas e aparelhagem específica, como por exemplo o volume do meio, aparatos, rotação, temperatura e tempo, ou seja, para a realização do ensaio de dissolução é necessário a utilização de um equipamento específico chamado dissolutor (Figura 1), que é constituído por:
– Cubas: local onde o meio de dissolução é adicionado e também onde ocorerá a dissolução;
– Aparatos: I (cestos) e II (pás), com o auxílio de um motor é ajustado a velocidade de rotação dos aparatos gerando, assim, a hidrodinâmica que é responsável pela desintegração e dissolução da forma farmacêutica;
– Revervatório de água: também chamado de banho, local onde a água é aquecida e por troca de calor aquece o meio de dissolução dentro da cuba.
Figura 1: Alguns aparatos de dissolução, ilustração do processo (cubas), Dissolutor.
Qual a importância do ensaio de dissolução para a Indústria Farmacêutica?
O ensaio de dissolução é considerado o ensaio mais importante para uma forma farmacêutica sólida, pois é o ensaio in vitro que mais se assemelha com o comportamento in vivo, uma vez que, para que um fármaco seja absorvido é necessário que ocorra a desintegração e a dissolução e esses dois parâmetros é posssível verificar no teste de dissolução.
Além disso, o teste de dissolução é imprescindível para o desenvolvimento e estabilidade de formulações, avaliação do processo de fabricação, detecção de desvios de fabricação e diminuição do risco da falta de bioequivalência entre lotes, podendo ser utilizada para obter a bioisenção do produto.
Figura 2: A importância dos teste de dissolução e para que ele se aplica.
Autor: Igor M. Santana, M.Sc. , Pesquisador a nível doutorado, Departamento de Química Analítica, Instituto de Química da Unicamp
Em um post anterior (que pode ser lido clicando aqui: https://cromvallab.com/2020/09/12/voce-conhece-a-cromatografia-convergente-e-a-cromatografia-unificada/o aqui), foi falado da cromatografia de convergência (CC) e suas diferenças para as tradicionais cromatografia líquida (LC) e gasosa (GC). Nesse post, detalharemos um pouco mais sobre essa técnica que surgiu no começo dos anos 60, mas não alcançou a mesma popularidade de LC e GC. A CC também pode ser conhecida pelo seu nome popular, cromatografia com fluido supercrítico (ou SFC). Por isso, é preciso primeiro entender o que é um fluido supercrítico e como suas propriedades aplicam-se à cromatografia.
O fluido supercrítico está em uma condição de pressão e temperatura na qual líquido e gás coexistem, mas sem haver uma separação entre eles. Por exemplo, a água em ebulição: é possível ver onde o líquido termina e onde o vapor começa, através da formação de bolhas, condição na qual chamamos de separação de fases. Em um fluido supercrítico, as propriedades do líquido e do gás, como densidade e viscosidade, convergem a tal ponto em que se tornam uma fase só (Figura 1). Em outras palavras, as propriedades de um fluido supercrítico são intermediárias às de um líquido e de um gás, principalmente sua densidade e viscosidade, importantes para processos cromatográficos.
Figura 1. Transformação do CO2 em um fluido supercrítico (sem a separação de fases líquido-gás) ao aumentar a pressão e temperatura.
Hoje, o principal fluido usado é o CO2 por apresentar condições críticas (pressão e temperatura) brandas em comparação a outras substâncias. Porém, como o CO2 é uma substância muito apolar, é necessário misturá-lo com modificadores polares (como metanol) para ter força suficiente para eluir compostos mais polares, que costumam ser mais retidos na fase estacionária com essa técnica. A adição de modificadores orgânicos altera as propriedades do fluido, principalmente a temperatura crítica, e parte do processo de separação ocorre em uma condição abaixo dessa temperatura, sendo chamada de subcrítica. No entanto, na prática não há diferença significativa entre as condições supercrítica e subcrítica desde que as propriedades do fluido permaneçam contínuas, ou seja, sem separação de fases (é por isso que a instrumentação em SFC requer um item a mais que um instrumento de HPLC tradicional, chamado de regulador de pressão de retorno ou backpressure regulator, BPR) [1]. Como consequência, o termo “supercrítico” não é mais adequado para designar essa técnica cromatográfica, permanecendo apenas por motivos históricos. A característica mais marcante é a compressibilidade do fluido, ou seja, maior sensibilidade a mudanças de pressão e temperatura em comparação a uma fase puramente líquida. O nome cromatografia de convergência (CC) usado pela Waters é pertinente, pois a fase móvel pode convergir nos estados supercrítico, subcrítico (mais comum) e líquido em uma única corrida.
A principal aplicação da CC tem sido na resolução enantiomérica de fármacos, de forma que é vista como substituta ideal para métodos compendiais que empregam cromatografia líquida em fase normal (NPLC). A NPLC emprega solventes agressivos ao meio ambiente (como derivados de petróleo e solventes clorados), tem equilíbrio lento com a fase estacionária e não tem compatibilidade com espectrometria de massas (MS). Por sua vez, o fluido usado em CC (predominantemente CO2 pressurizado) é ecologicamente mais amigável (não inflamável e não tóxico), além de ser mais barato. Além disso, a viscosidade do fluido é muito menor, o que resulta em corridas de 3 a 5 vezes mais rápidas. Como a maior parte da fase móvel é um gás em pressão ambiente, seu acoplamento com MS é facilitado. Por exemplo, o método USP para análise de tolazamida, um fármaco redutor de glicemia, emprega NPLC com grande consumo de hexano, de origem fóssil. O tempo total de análise chega a 30 minutos, a uma vazão de 1,50 mL/min com uma coluna Agilent Zorbax RX-Sil 4,6 x 250 mm, partículas de 5 µm, gerando um resíduo de 43 mL somente de hexano. Sua substituição por SFC reduz o tempo total de análise para 5,5 minutos com a mesma coluna, mas com uma vazão de 3 mL/min. A Figura 2 apresenta os cromatogramas e o resultado para o system suitability, mostrando que ambos os métodos atendem ao critério USP [2]. No caso de SFC, o consumo total de solvente chegou a 16,5 mL, mas gerou apenas 1,0 mL de resíduo para ser tratado, pois a maior parte da fase móvel (CO2) evapora ao fim da análise. Esse caso mostra a nítida economia de tempo (e financeira), que pode ser obtida também em outros métodos onde NPLC ainda é empregada.
Figura 2. Comparação entre métodos NPLC e SFC para tolazamida com base em critérios USP. Adaptado da referência 2.
Outra aplicação vantajosa da CC é a separação ortogonal em comparação à cromatografia líquida em fase reversa (RPLC). A RPLC é o modo cromatográfico mais empregado em indústrias farmacêuticas, porém, falha em obter boas retenções de compostos polares. Agências regulatórias têm exigido o controle de produtos de degradação de IFAs (possíveis metabólitos), os quais costumam ser mais polares, dificultando a sua quantificação por RPLC, ou com estruturas muito similares, apresentando baixa resolução. Uma alternativa é o uso de NPLC ou de cromatografia por interação hidrofílica (HILIC), técnicas ortogonais à RPLC.
Além das desvantagens já discutidas de NPLC, a HILIC depende de grande quantidade de acetonitrila, um solvente mais caro, além de requerer maior tempo de equilíbrio quando eluições gradientes são empregadas, demandando mais tempo por análise. A retenção de compostos apolares também é menor nesse modo. A CC é uma opção viável a estas técnicas por apresentar comportamento ortogonal: a fase móvel é apolar (ao contrário de RPLC e HILIC), e a fase estacionária pode ser tanto polar (sílica, usada em HILIC) como apolar (C18, usada em RPLC). A aplicação direta dessas características é a possibilidade de se obter perfis cromatográficos complementares com apenas duas corridas (uma em CC e outra em RPLC, por exemplo), permitindo ver o maior número de picos com o menor número de alteração experimental (como pH ou fases estacionárias). No exemplo da Figura 3, realizou-se um estudo de produtos de degradação da ondansetrona (medicamento usado para reduzir efeitos de tratamentos quimioterápicos), porém dois produtos (impurezas E e F, mais polares) não foram retidos em nenhuma condição RPLC [3]. O método empregando CC conseguiu reter as impurezas E e F o bastante para quantificá-las em um intervalo de tempo semelhante. No entanto, o IFA e a impureza A coeluem, embora a detecção com espectrometria de massas consiga selecioná-las individualmente. Note também que as impurezas C e D, que são mais retidas no método RPLC, são compostos menos retidos no método CC, evidenciando a seletividade ortogonal de ambas as técnicas cromatográficas.
Figura 3. Comparação da seletividade ortogonal de RPLC com CC para análise de ondansetrona e seus produtos de degradação. Adaptado da referência 3.
Embora a CC seja bem estabelecida em indústrias farmacêuticas, ainda é nítida a resistência que existe no Brasil em introduzir essa técnica no rol analítico. Talvez os principais embargos sejam a aquisição inicial (mais caro que instrumentos UPLC) e a necessidade de mais treinamentos por tratar-se de um modo cromatográfico não convencional (porém, na prática, o usuário de HPLC logo percebe que a operação é similar). Apesar do custo inicial, a alta produtividade e baixa geração de resíduos, além de propriedades complementares à RPLC, tornam a CC economicamente viável a longo prazo. Ainda, essa técnica é complementar a muitos outros modos de HPLC a partir de modificações simples na fase móvel (enquanto as características de outros modos cromatográficos são drasticamente distintas, como RPLC e NPLC, dificultando análises ortogonais). A Figura 4 mostra um resumo simplificado dessa complementaridade [4].
Figura 4. Comparação entre SFC (ou CC) e diferentes modos de cromatografia líquida. A CC é uma opção complementar interessante à LC. Adaptado da referência 4.
A cromatografia, e principalmente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), está presente no dia a dia de vários laboratórios e analistas. Ao mesmo tempo poderosa, versátil, flexível e complexa!
Dominar a rotina básica de aquisição de dados cromatográficos é relativamente simples, porém, mesmo os mais experientes analistas sabem que o HPLC também pode ser uma “caixinha de surpresas” e de novos desafios diários relacionados com desenvolvimento de métodos e troubleshooting.
Vencidos os possíveis empecilhos para iniciar uma aquisição de dados, a etapa mais importante e trabalhosa se concentra em estabelecer o melhor processamento dos resultados e a melhor integração de picos cromatográficos, pois o tipo de integração irá impactar no resultados real a ser obtido na análise cromatográfica.
Obviamente, quanto melhor for realizado o desenvolvimento do método de separação em si, isto é, quanto melhor estabelecidos estiverem os parâmetros de separação das substâncias presentes na mistura, mais rápido e assertiva será a integração dos picos. Se o método estiver permitindo obter picos bem separados, de área e altura adequados em relação ao ruído, mais simples será a integração (dependendo apenas da determinação dos melhores valores de threshold e peak width). A Figura 1 exemplifica como a escolha correta dos valores de peak width e threshold (também conhecido como slope sensitivity) são importantes. Lembre-se também que o valor de peak width medido para o menor pico do cromatograma deve ser utilizado para definir a taxa de aquisição de pontos, na aquisição de dados (mantendo o valor de 15 a 20 pontos por pico como um valor ideal).
Figura 1. Ilustração da importância da escolha dos valores adequados de peak width e threshold. Note que com valores muito altos ou muito reduzidos os picos são integrados de forma errada ou não são detectados.
A Figura 2 abaixo ilustra a separação de picos cromatográficos:
A primeira ilustração representa uma separação excessiva entre as substâncias, o que acarretará um tempo de análise maior que o necessário
A segunda ilustração representa uma separação ideal, com resolução adequada
A terceira ilustração representa uma separação não adequada, com picos com pouco separação, co-eluindo e mantendo uma zona de mistura entre os dois compostos que podem ser identificados. Estes picos são chamados de picos fundidos e a maior variação de resultados, devido a diferentes possibilidades de integração, ocorrem com esta categoria de picos.
A quarta ilustração não pode ser aceita, pois a co-eluição é praticamente completa, com uma zona de mistura praticamente completa entre os compostos.
Figura 2. Ilustração demonstrando a separação de picos desejada.
E quais são as possibilidades de métodos de integração de picos fundidos, como os ilustrados na Figura 2?
A Figura 3 mostra as principais opções de tipos de integração de picos fundidos.
Figura 3. Principais tipos de integração.
A escolha da melhor integração depende de algumas características e objetivos, mas deve-se considerar que é imprescindível que tanto padrão como amostras sejam processados com o mesmo método para reduzir os erros dessas integrações de picos fundidos, que já são mais sujeitos a erros e variações.
A Figura 4 ilustra um exemplo do poder de ajuste que o algoritmo ApexTrack possui.
Figura 4. Exemplos da habilidade de integração que o algoritmo ApexTrack possui.
A Figura 5 apresenta um exemplo do uso do i-PeakFinder, do LabSolution (Shimadzu), completamente automatizado.
Figura 5. Exemplo de integrações automáticas obtidas pelo algoritmo i-Peak Finder do LabSolution (Shimadzu).
O CDS Chromeleon, da Thermofisher, também possui ferramentas para auxiliar na tarefa de integrar picos adequadamente. O algoritmo Cobra e o assistente de integração chamado SmartPeaks são responsáveis pelo auxílio. A Figura 6 demonstra a funcionalidade dessas ferramentas.
Figura 6. Opções de integração do Assistente SmartPeaks.
De forma geral, os erros de integração são praticamente ausentes com resoluções de 2,0 ou mais. Quando as integrações são similares em resultados obtidos, o método de drop integration será então o mais conveniente.
Para resoluções entre 1,5 e 1,0, tanto o método drop ou Gaussian Skim produzem os menores erros se os 2 picos vizinhos tiverem aproximadamente o mesmo tamanho (o pico menor pode ser no máximo 5% menor apenas). O método de valley to valley conduz aos maiores erros negativos, principalmente para pequenos picos. O método exponential skim pode ser inválido para estes casos e conduz a erros negativos significantes para sholder peaks (ombros). Em geral, nesta situação, as medidas de altura levarão a erros menores do que as medidas de áreas. Portanto, o drop method usando altura pode ser a melhor escolha. Uma integração com método Gaussian Skim também pode ser uma escolha aceitável, entretanto, este ainda é um método relativamente mais novo e vários software ainda estão se adaptando.
Assim, como conclusão final, retornamos a Figura 2, pois para reduzirmos os erros de integração, de fato, deve-se priorizar métodos com resolução maior que 2,0. No caso de picos com tamanhos similares é possível aceitar resoluções da ordem de 1,5 e com escolhas de métodos de integração melhores ainda encontrar erros de magnitude aceitável. Porém, resoluções da ordem de 1,0 devem ser evitadas pois o aumento nos erros de integração são significativamente maiores, mesmos com os melhores métodos de integração.
Veja a Figura 7 como exemplo/ilustração das diferenças de métodos de integração em diferentes proporções de tamanho de picos.
Figura 7. Com resoluções abaixo de 1,5 a escolha do método de integração de picos adjacentes deve ser cautelosa, levando em consideração a diferença de tamanho dos picos.
Espero que tenham gostado do post, lembrando que uma discussão sobre o assunto será abordada em nossa Live do dia 22 de julho de 2021 (no canal da Cromvallab no Youtube) e o vídeo ficará disponível.
Observações:
Este assunto é parte integrante do nosso Curso Dominando os Principais CDS Empower e OpenLab e teremos uma aula adicional com aprofundamento e discussão dos algoritmos tradicionais de integração e ApexTrack em breve
No curso Operação de HPLC: do zero ao 100% o processamento e integração de picos cromatográficos são discutidos e exemplificados na prática, utilizando o OpenLab e Empower.
Dúvidas ou comentários?
Escreva cromvallab@gmail.com
Aproveite e me siga e também siga a Cromvallab nas redes sociais.
CROMVALLab - Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão 