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O que é Dwell Volume e Dead Volume e como eles interferem no desenvolvimento ou transferência do seu método por HPLC?

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

O dwell volume, que pode ser traduzido como tempo de permanência, representa o volume entre a câmara de mistura de fase móvel (conhecido como misturador) e a entrada da coluna cromatográfica. Cada equipamento tem um dwell volume, dependendo do misturador e se a mistura ocorre a baixa ou alta pressão. Veja na Figura 1 uma representação ilustrando a diferença de dwell volume.

Figura 1. Representação do dwell volume em dois diferentes tipos de sistemas: com misturas à alta pressão (sistemas de bombas binárias) e com misturas à baixa pressão. Observe que o dwell volume é maior em sistemas com misturas de fase móvel à baixa pressão, mas este valor também depende do volume do misturador presente no sistema.

O dwell volume inclui o volume da câmara de mistura de solventes de fase móvel, o volume das tubulações (do misturador até a bomba e da bomba até o injetor e do injetor até a entrada da coluna); a bomba com suas cabeças e check valves e o injetor (no caso de sistemas à baixa pressão – que são os mais comuns).

Portanto, como o dwell volume varia nos sistemas cromatográficos, ele interfere no resultado de um método descrito com a utilização de gradiente ou em métodos nos quais a eluição é isocrática mas a composição é preparada na bomba do HPLC (interferência menor).

No caso de eluição por gradiente, o dwell volume altera o delay time (tempo de atraso da mistura no gradiente) e portanto é possível que um método executado em diferentes equipamentos mostrem resultados de separação bem distintos (pois a composição da FM na coluna será diferente, alterando a resolução visualizada).

A Figura 2 ilustra a diferença deste volume em relação a 2 equipamentos importantes na área de cromatografia líquida.

Figura 2. Comparativo entre o dwell volume entre os equipamentos Agilent 1100 e Alliance (Waters).

Esta diferença de volume ilustra que se houver uma transferência de método envolvendo esses dois equipamentos citados na Figura 2, o resultado será diferente e o dwell volume deverá ser corrigido, corrigindo-se o tempo do gradiente (o dead volume ou void volume dos sistemas também poderá influenciar, principalmente causando alargamento de banda, como será visto a baixo).

Se o dwell volume é diferente, os tempos de retenção e as resoluções serão diferentes (as larguras de pico também podem variar), utilizando equipamentos distintos, mesmo com o mesmo método e a mesma coluna.

A Tabela 1 apresenta o comparativo entre os dwell volume (VD) para diferentes equipamentos de cromatografia da Waters.

A Figura 3 apresenta um resultado cromatográfico evidenciando a diferença de tempo de retenção devido diferentes VD.

Figura 3. Cromatograma comparativo obtido em equipamentos com diferentes dwell volume (mudança no tempo de retenção).

A Figura 4 ilustra a mudança de resolução entre picos em situações nas quais o dwell volume varia.

Figura 4. Impacto de diferentes dwell volumes na resolução.

Dwell volume x dead volume (void volume)

O volume morto não pode ser confundido com o dwell volume!

O volume morto (ou volume extra coluna) representa qualquer volume adicional, como pequenos espaços em conexões malfeitas, volumes adicionais causados por tubulações de comprimento ou diâmetro maior que o ideal e até mesmo canais ou espaços abertos no recheio da coluna devido a degradação do suporte da fase estacionária.

A Figura 5a ilustra o volume morte devido a conexões, um dos principais problemas relacionados com alargamento e distorção de banda, especialmente em sistemas de UPLC. A Figura 5b ilustra como o pico cromatográfico pode ser distorcido ou alargado ou ficar com caudas devido a volumes mortos no sistema.

Figura 5a. Conexões malfeitas (em a causando vazamento, em b causando volume morto) e conexão ideal em c.

Figura 5b. Ilustração da banda cromatográfica sendo eluida e sofrendo alargamento devido a existência de volume adicional no caminho, causando cauda e alargamento no pico.

A Figura 6 apresenta um cromatograma de exemplo de resultado ideal desejável e de picos com distorções causadas por volume morto no sistema.

Figura 6. Cromatograma comparando resultados obtidos com conexões ideais e conexões que causam cauda nos picos.

A diferença nos volumes de célula de detectores UV também podem representar uma diferença nos resultados cromatográficos, pois o volume da célula do detector pode contribuir para uma redução de eficiência e, portanto, de resolução de picos, pois contribuem também para alargar a banda cromatográfica (mesmo que em pequena extensão).

A Tabela 2 apresenta uma comparativo entre volumes de célula de detector de diferentes equipamentos Agilent e a Figura 7 ilustra a diferença entre a resolução de picos obtidos com o mesmo método e a mesma coluna, porém em equipamentos com diferentes volumes de célula de detector.

Tabela 2

Figura 7. Resultado cromatográfico comparativo: célula de detector com menor volume permite obter melhores resoluções entre os picos.

Como calcular o dwell volume?

Quando o gradiente se inicia, a coluna demora para receber a proporção real do gradiente e este atraso (delay time) é proporcional ao dwell volume do equipamento.

O dwell volume é igual o tempo entre a injeção e a metade da altura do traço do pico, multiplicado pela vazão da fase móvel (fluxo), medido usando um gradiente.

Uma possibilidade simples para executar a medida é:

  • remover a coluna e usar um conector de volume morto zero ou um tubo capilar de 1m x 0,125 mm de diâmetro interno para conectar o injetor ao detector
  • utilize água grau HPLC no canal A e água grau HPLC + 0,1% de acetona no canal B
  • Utilize 265 nm para fazer a medida
  • Corra um gradiente de 0-100% de B durante 20 minutos, a 2 mL/min (ou um gradiente de 10 a 60 min a 1-2 mL/min)

O injetor deve ser usado pois também faz parte da medida do dwell volume. Pode ser injetada água grau HPLC para correr o gradiente.

Alternativamente, o canal B pode conter propil parabeno ou cafeína 10 mg/L (o comprimento de onda deve ser ajustado).

A Figura 8 representa o esquema da medida do dwell volume, utilizando a curva de gradiente obtida.

HPLC Solutions #86: Measuring Dwell Volume

Figura 8. Cálculo de delay time do gradiente e posterior conversão em dwell volume, multiplicando pela vazão de fase móvel.

Um exemplo de curva obtida ne medida pode ser vista na Figura 9.

Figura 9. Medida de dwell volume: neste exemplo o tempo de 50% do gradiente e o tempo de início do gradiente são 4,04 e 2,00 min, respectivamente.

Torna-se interessante também medir o volume morto e o alargamento de banda do sistema. Essas medidas podem ser realizadas usando um conector de volume morto zero, substituindo a coluna e uma substância que permita ter um bom sinal, como uma solução de cafeína. A Figura 10 ilustra essas medidas.

Figura 10. Medida de volume morto do sistema sem coluna e alargamento de banda.

Gostou do post?

Já teve problemas com transferência de métodos entre equipamentos diferentes?

Estes e vários pontos de troubleshooting são discutidos e avaliados em nosso curso de Troubleshooting e Manutenção de HPLC. Entre em contato!

Abraços!

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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FASE REVERSA X FASE NORMAL: O QUE PODE DAR ERRADO?

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

Se você trabalha com HPLC já deve ter sido surpreendido várias vezes. Fases móveis diferentes, colunas diversas, condições inusitadas…e nem sempre toda essa diversidade funciona na primeira tentativa. Muitos são os desafios e as oportunidades de aperfeiçoamento e quando compreendemos, tudo finalmente dá certo e o resultado cromatográfico é maravilhoso.

Mas no meio do caminho e dos testes, as vezes algo pode não sair tão bem…Já aconteceu com você de uma coluna simplesmente ser destruída pelo uso de solventes inapropriados? Você já viu uma câmara de mistura “derreter” ou selos e válvulas não suportarem o uso de solventes inapropriados para o material?

Essas coisas as vezes acontecem porque nem sempre nos diversos métodos que recebemos estão inseridas todas as informações necessárias e, em outras vezes, também não temos conhecimento exato dos materiais e devidas compatibilidades químicas dos selos, pistões, rotores ou conexões instaladas no HPLC.

A Figura 1 apresenta uma lista de materiais possivelmente presentes no equipamento e muitas vezes o uso de fase reversa ou normal pode obrigar a substituir algum material.

E quando precisamos inverter a fase de eluição no HPLC, o que devemos considerar? Quais solventes serão envolvidos?

As vezes até o pH deve ser considerado, pois alguns itens do equipamento (e não só a coluna com suporte de sílica) são incompatíveis com pH’s extremos.

A Figura 2 apresenta algumas considerações a respeito do pH e a fragilidade de itens do HPLC (extraído do manual do usuário da Agilent).

Na questão sobre o uso de fase reversa (FR) e fase normal (FN), geralmente os solventes mais agressivos são hexano e THF e o ponto mais importante é seguir o procedimento de inverter o sistema (solventes de FR para FN, e vice-versa) adequadamente, para não prejudicar o sistema, já que os solventes destes dois modos de eluição são incompatíveis. O isopropanol funciona como um agente de compatibilidade entre as duas formas de eluição e o uso correto dele é imprescindível.

Os slides abaixo apresentam um resumo e um breve comparativo e indicações sobre o uso de fase reversa e fase normal.

Qual a peça mais importante? Informação e conhecimento!

Se ficou com alguma dúvida, por favor entre em contato!

Temos vários cursos que podem auxiliar no entendimento e uso da cromatografia…

Abraços

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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As principais vantagens do uso de ICP-OES e ICP-MS na determinação de impurezas elementares em medicamentos

Autoras:

Me Fernanda de Godoy Grecca (Mestre em Ciências pela Universidade de São Paulo, especialista em AAS e ICP -OES com mais de 10 anos de experiência em preparo de amostras das mais diversas matrizes e posterior análise de metais pelas técnicas mencionadas. Com conhecimento de legislações ambientais, farmacopeias e ISO 17025).

e

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

O que são impurezas elementares?

Basicamente, são metais que podem estar presentes no Insumo Farmacêutico Ativo (IFA) ou no Produto Acabado, devido o uso de catalisadores metálicos, contaminações devido a interações com equipamentos e utensílios de manipulação, podem ser contaminações ambientais e oriundos de outras fontes durante as sínteses do IFA, dos excipientes ou o processo de produção do produto em si.

A segurança na fabricação de produtos farmacêuticos é uma questão de saúde pública de extrema importância. Neste sentido, o controle das impurezas elementares é essencial, de forma que o medicamento produzido seja seguro para o consumo.

A United State Pharmacopeia (USP) que é uma grande referência em métodos para análises na indústria farmacêutica, em seu capítulo 233 (Método Geral <233>), recomenda o uso de ICP-OES e ICP-MS para as análises de impurezas elementares. O capítulo 232 (Método Geral <232>) por sua vez aborda os limites permitidos dessas impurezas nos medicamentos (Figura 1: resumo).

Figura 1. Resumo do contexto envolvido na análise de impurezas elementares.

O guia internacional ICH Q3D também recomenda o controle dessas impurezas devido a sua elevada toxicidade. Esse guia divide esses elementos em 3 classes de acordo com a sua toxicidade e a dose de exposição diária permitida (PDE), conforme mostrado na Tabela 1 abaixo:

Tabela 1. Classificação dos elementos pelo ICH Q3D, conforme toxicidade e PDE.

É importante ressaltar também que outros elementos como: Al, Ca, Fe, K, Mg, Mn, Na e Zn, os quais o PDE não foi estabelecido ou que possuem baixa toxicidade inerente, também podem ser monitorados por representarem risco ao organismo humano em concentrações elevadas.

O ICP-OES (Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado) e o ICP-MS (Espectrometria de Massas com Plasma Indutivamente Acoplado) são duas técnicas analíticas para a determinação de metais que permitem a detecção simultânea de vários elementos com limites de detecção e quantificação bastante baixos, atingindo até a ordem de “partes por trilhão” (ppt – caso do ICP-MS).

O que diferencia as duas técnicas é a forma como o sinal analítico é gerado em cada uma: no ICP-OES ocorre uma propagação da radiação e no ICP-MS os íons gerados devem ser transferidos para o espectrômetro de massas.

Alguns exemplos de ICP-OES e ICP-MS disponíveis no mercado estão ilustrados na Figura 2 abaixo:

Figura 2. Modelos de ICP-OES e ICP-MS disponíveis no mercado (As imagens foram retiradas dos sites da Agilent, Analytik Jena, PerkinElmer e Thermo Fisher Cientific).

Por possibilitarem a análise multi-elementar desses elementos citados pela USP e pelo ICH Q3D, com limites de detecção muito baixos, o ICP-OES e o ICP-MS são técnicas altamente relevantes para os profissionais da indústria farmacêutica.

Uma técnica alternativa, como a Espectroscopia de Absorção Atômica com Chama (FAAS), pode ser usada somente se o método tiver sido validado e atender a critérios de aceitação recomendados. A FAAS pode ser apropriada para caracterizar poucos elementos presentes em concentrações maiores em matérias primas. Porém, é improvável atender a necessidade de análise de produtos acabados, nos quais os níveis de concentração são muito menores e é desejável melhor exatidão.

Comparação entre ICP-OES e ICP-MS

Alguns pontos importantes a serem discutidos no comparativo entre as técnicas de ICP-OES e ICP-MS:

  • Limites de detecção:

ICP-MS tem LD ao redor de 3 ordens de grandeza menores que os limites encontrados para ICP-OES, para a maioria dos elementos. Essa diferença em geral é causada pelo fato do ICP-MS ser mais tolerante a interferências causadas pela matriz, do que o ICP-OES, que necessita de diluições maiores da amostra. O LD do ICP-OES pode ser útil para analisar matérias primas e para produtos farmacêuticos de via oral nos quais os limites de PDE são maiores.

Já o ICP-MS atinge limites de detecção da ordem de partes por trilhão para todos os elementos que devem ser monitorados. Esses limites permitem ainda atingir exatidão nas determinações incluindo várias formas farmacêuticas, como parenterais ou drogas de inalação, que tem níveis de PDE menores do que os exigidos para medicamentos de via oral. Assim, o ICP-MS oferece flexibilidade para atingir os limites requeridos na regulamentação, para todos os elementos e para todos os tipos de amostras.

  • Diluição

Os níveis de diluição aplicados durante o preparo de amostra devem ser considerados no comparativo. Se uma pequena quantidade de amostra está disponível, uma diluição maior será necessária para alcançar o volume de amostra para análise e, neste caso, o ICP-MS requer maiores diluições por ser mais sensível á sólidos dissolvidos. O uso de diluições maiores reduz a concentração alvo (valor J) na solução e então valores de LD menores são requeridos para permitir a análise. Similarmente, amostras que contem alto nível de sólidos dissolvidos devem ser diluídas antes da análise e o ICP-MS, por ser mais sensível a sólidos, irá requerer maior diluição do que o ICP-OES (o equipamento ICP-OES 5800 Agilent pode medir amostras com até 25% de sólidos em suspensão, enquanto o ICP-MS tolera ao redor de 0,2% de sólidos – sem o sistema com Ultra High Matrix Introduction (UHMI), que melhora em quase 100 x a tolerância).

De qualquer forma, os menores LD do ICP-MS garantem maior flexibilidade na escolha do nível de diluição apropriado para procedimentos de preparo de amostra.

  • Especiação

Muitos limites de toxicidade são dependentes da especiação (estado de oxidação do elemento e complexação na forma de organometálicos). A análise de especiação requer o acoplamento da cromatografia líquida com o ICP-MS.

A Figura 3 apresenta um sistema de LC integrado com ICP-MS para permitir a análise de especiação de impurezas elementares.

Figura 3a. Equipamento LC-ICP-MS
Figura 3b. Resultados de análise de especiação
  • Rapidez da análise

ICP-OES é uma técnica de análise rápida, permitindo a análise de aproximadamente 2x mais amostras do que o ICP-MS (em 24h o ICP-OES pode medir 2500 amostras, comparado com 1200 amostras no ICP-MS). Assim, laboratórios com alta demanda de amostras de dose oral e com menores fatores de diluição podem se beneficiar do uso de ICP-OES.

  • Custo e facilidade de operação

Os instrumentos de ICP-OES representam menor investimento (menor custo) para aquisição e para manutenção quando comparados com ICP-MS. Há, geralmente, poucas variáveis operacionais para setup no ICP-OES e analistas tem maior familiaridade com as opções disponíveis. Entretanto, equipamentos mais modernos de ICP-MS já estão sendo configurados por seus fornecedores com métodos e rotinas automatizadas, simplificação de workflows e assim permitem boas performances mesmo com analistas menos experientes, o que reduz o tempo de treinamento necessário também.

Preparo da amostra e limites de detecção alcançados com ICP-MS: exemplos

Tem sido demonstrado que a dissolução direta em meio aquoso é uma opção interessante de preparo de amostra farmacêuticas solúveis em agua, para posterior análise de acordo com método USP <233> usando ICP-MS.

Dissolução indireta via vaso fechado com digestão por micro-ondas, entretanto, é reconhecida como o preparo de amostra mais abrangente, compatível com diferentes amostras e subsequente análise por ICP-MS. Uma vantagem importante do vaso fechado e digestão por micro-ondas é a retenção de elementos voláteis, em particular o mercúrio, que em outras formas de preparo de amostra poderia ser perdido.

Em um exemplo de aplicação descrito pela Thermofisher (APPLICATION NOTE 43325), ácidos fortes, como sulfúrico e nítrico foram adicionados à amostras em vials de vidro e os mesmos foram transferidos para o sistema de digestão de micro-ondas, sendo os vials fechados, pressurizados com nitrogênio a 40 bar e foram aquecidos seguindo um programa de temperatura (conforme Tabela 2). Digestões a altas pressões são recomendadas por permitirem utilizar baixas temperaturas e assim minimizar a perda de elementos voláteis.

Tabela 2. Programação de aquecimento utilizado em digestão por micro-ondas em vaso fechado, para produtos farmacêuticos

Após resfriarem, as amostras foram transferidas para vials de polipropileno e soluções aquosas ácidas tiveram suas concentrações ajustadas. Usando curvas de calibração externa, os elementos descritos na Tabela 3 foram analisados, tendo como referência os valores de PDE e os respectivos limites alvo (J) calculados, de acordo com a equação abaixo:

Tabela 3. Valores de limite alvo J calculados para 14 elementos presentes no método USP <233>. PDE considerado para pessoas de 50 kg e dose diária máxima considerada como 10g.

A Tabela 4 descreve os limites de detecção obtidos utilizando o método descrito, podendo-se notar que são bem menores que os limites alvo J necessários de serem monitorados.

Tabela 4. Limites de detecção instrumental (LOD baseado em 3x o desvio padrão obtido para o branco), concentração de background equivalente (BEC , reportada em ng/g) e resultados de limite de detecção do método (MDLs, reportados em μg/g) para elementos definidos no método USP <232>.

A Tabela 5 ilustra outros valores de limites de detecção, comparados com valores alvo J descritos para os elementos Cd, Pb, As e Hg reportados na nota de aplicação 5991-8149EN da Agilent (2021).

Tabela 5. Comparação entre os valores limites alvo e os limites de detecção mínimos atingidos utilizando o equipamento ICP-MS Agilent 7850. (* doses diárias menores que 10g, ** formas inorgânicas).

Na Tabela 5 também se observa valores bem inferiores aos limites necessários, comprovando a alta qualidade e perfeito atendimento as regulamentações permitidos com a técnica de ICP-MS.


Tem dúvidas ou comentários?

Escreva: cromvallab@gmail.com

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ISO 17025:

Como tudo começou e qual a importância de ter um laboratório acreditado hoje!

(Dra. Cláudia Hoffmann Kowalski Schröder)

Qualidade pode ser definida como o atendimento às necessidades e expectativas do cliente.

Mas as necessidades e expectativas mudaram no decorrer do tempo e a forma de conceber qualidade também mudou de uma abordagem corretiva para uma abordagem preventiva.

Abordagem corretiva: “Age quando algo dá errado!”

Abordagem preventiva: “Age para prevenir que algo dê errado!”

Na metade do século XX as Normas ISO foram criadas e em seguida normas específicas para diferentes áreas foram desenvolvidas, como a ISO Guide 25 para a área de laboratório. Após várias revisões, a versão atual é a ABNT NBR ISO/IEC 17025:2017 – Requisitos Gerais para Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração.

A ISO 17025 tem como objetivo promover a confiança na operação de laboratórios de ensaio e calibração e possuem requisitos para que os laboratórios demonstrem que operam com competência e que são capazes de gerar resultados válidos.

Trazendo para a nossa área (química, farmacêutica, alimentos, ambiental, forense), ela é aplicável a todos os tipos de ensaios, como ensaios físico-químicos, microbiológicos, bromatológicos, cromatográficos entre outros. Cada laboratório escolhe qual escopo vai submeter a acreditação e os auditores do INMETRO farão então a auditoria em todos os processos submetidos.

Cada país tem o seu Organismo de Acreditação, e no Brasil, o responsável por acreditar escopos de laboratórios é o INMETRO, através da Coordenação Geral de Acreditação (CGCRE). Acreditação é um atestado dado pelo INMETRO à um laboratório que demonstra formalmente sua competência para realizar determinado ensaio ou calibração.

Muitas vezes o termo “acreditação” é confundido com “habilitação”. Então vale lembrar que a acreditação é dada (ou não) pelo INMETRO à um escopo que foi submetido a avaliação. Já a habilitação na Rede Brasileira de Laboratórios Analíticos em Saúde (REBLAS), por exemplo, é fornecida pela ANVISA aos laboratórios analíticos que realizam análises em produtos sujeitos a vigilância sanitária, e que podem ter o sistema de gestão da qualidade da ISO 17025 implementada, conforme artigo 7 da RDC 390 de 26/05/2020.

Voltando a Norma ISO 17025, a maioria dos países fazem parte do acordo de reconhecimento mútuo, ou seja, um laudo de ensaio físico-químico emitido por um laboratório acreditado no Brasil é válido na Alemanha e um laudo de ensaio microbiológico emitido por um laboratório acreditado nos Estados Unidos é válido no Brasil, por exemplo!

Vale ressaltar que a acreditação é um processo voluntário do laboratório, mas devido à sua importância global, hoje em dia, é muito difícil sobreviver no mercado sem a acreditação!

E como saber se um laboratório é acreditado? A forma mais fácil de obter essa informação é pelo próprio site do INMETRO:

http://www.inmetro.gov.br/qualidade/iaac/laboratorios.asp

Quer ter o nome do seu laboratório nesta lista do INMETRO também?

Quer conhecer mais sobre o assunto?

Escreva que podemos ajudá-lo!


Dra. Cláudia Hoffmann Kowalski Schröder

Mini-currículo:

Cláudia Hoffmann Kowalski Schröder é farmacêutica pela Universidade Federal de Santa Maria, doutora em Ciência de Alimentos pela Unicamp e fez pós-doutorado na área de Química Analítica, também pela Unicamp.

Atua na área de consultoria com implementação e auditoria da Norma ISO 17025, controle e garantia da qualidade e desenvolvimento e validação de métodos analíticos, além da área de ensino, com treinamentos e produção de conteúdo didático para a disseminação de seu conhecimento.

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Quais as vantagens de utilizar o detector de espectrometria de massas acoplado à cromatografia líquida ou gasosa?

As técnicas cromatográficas ganharam destaque entre as técnicas analíticas devido a capacidade de separar diferentes constituintes presentes em matrizes complexas e, em teoria, permitir análise qualitativa e quantitativa de cada componente da mistura (amostra). Para análise qualitativa básica comparamos os tempos de retenção do padrão com o tempo de retenção do pico na amostra, considerando que as afinidades e interações permitem diferenciar diferentes estruturas químicas (mas isso é apenas uma aproximação, pois podem existir coincidências). Para a análise quantitativa comparamos a área ou a altura dos picos da amostra com as áreas ou a altura dos respectivos picos do padrão., obtidos nas mesmas condições, com os mesmos detectores.

Obviamente, várias condições são necessárias para atender os objetivos: desenvolvimento do melhor método (escolha de colunas, fases estacionárias, fases móveis, preparo de amostra, etc), escolha do equipamento e parâmetros operacionais adequados, uso de padrões e substâncias químicas de referência, tratamentos de dados e processamento.

Para uma boa análise tudo é importante! Mas precisamos de um bom cromatograma, gerado com um detector apropriado. A Figura 1 ilustra o resultado diferente obtido para a mesma amostra injetada utilizando dois detectores diferentes na análise de HPLC: um detector de arranjo de diodos (PDA – photodiodo array) e um detector de espalhamento de luz evaporativo (ELSD – evaporative light scattering detector).

Figura 1. Cromatogramas de HPLC obtidos com 2 diferentes detectores.

A Figura 2 ilustra a análise de uma amostra empregando 3 diferentes tipos de detectores de cromatografia a gás: detector de ionização em chama (FID – flame ionization detector), detector termiônico de chama (FTD – flame thermionic detector) e detector fotométrico de chama (FPD – flame photometric detector).

Figura 2. Cromatogramas obtidos empregando diferentes detectores de CG.

Detectores mais seletivos são mais sensíveis e permitem quantificação de concentrações mais baixas (atingem menores limites de detecção e quantificação). Porém, os detectores quanto mais seletivos mais irão “filtrar” os compostos a serem analisados de acordo com a propriedade físico química capaz de ser medida (menor quantidade de picos cromatográficos serão visualizados).

E os detectores de massas?

O acoplamento da cromatografia com a espectrometria de massas ampliou as opções e a confiabilidade das análises cromatográficas. Tendo o espectrômetro de massas como detector é possível realizar a confirmação da identidade de cada pico cromatográfico (extraindo os respectivos espectros de massas), quantificar os compostos e eventualmente eliminar interferentes da matriz ou co-eluições obtendo cromatogramas considerando massas/cargas específicas (no caso de utilizar MS/MS, muito útil na análise de baixas concentrações em matrizes complexas).

Assim, as principais vantagens do uso de espectrômetros de massa como detectores de cromatografia:

  • ser um detector universal
  • possibilidade de confirmação de identidade (análise qualitativa inequívoca utilizando o espectro de massa)
  • possibilidade de identificação de compostos mesmo sem o uso de padrões
  • possibilidade de quantificar sem falsos positivos
  • possibilidade de realizar a deconvolução de picos não separados (utilizando as massas/cargas)
  • possibilidade de eliminar interferentes da matriz e co-eluições (no caso de MS/MS – triplo quadrupolos)
  • aumentar a sensibilidade e seletividade do método
  • calcular pureza de pico cromatográfico

A Figura 3 ilustra um cromatograma obtido por GC-FID e GC-MS, comparativamente. Neste caso evidencia-se a possibilidade de obtenção de resultados muito similares com os dois detectores. Porém, com o detector de massas torna-se possível identificar os picos, mesmo sem o uso de padrões, obtendo os respectivos espectros de massas e utilizando bibliotecas disponíveis, ou confirmar a identidade dos picos com tempos de retenção coincidentes com padrões específicos utilizados, ou ainda verificar a pureza de cada pico eluido e descartar co-eluições comparando os espectros de massas extraídos em regiões diferentes do mesmo pico, melhorar a sensibilidade obtendo o cromatograma monitorando íons específicos e etc.

Figura 3. Cromatogramas da mesma amostra obtidos utilizando espectrômetro de massas como detector (no modo de cromatograma de íons totais – TIC) e FID.

A Figura 4 ilustra o processo de deconvolução de espectros de massas para separação de picos não separados.

Figura 4. Exemplo de melhoria de resultados de cromatograma com resolução ineficiente, mas separado per deconvolução empregando os espetros de massa. (extração de íons).

A Figura 5 mostra um cromatograma e os respectivos espectros de massa extraídos para cada pico.

Figura 5. TIC e espectros extraídos.

A Figura 6 demonstra um resultado obtido no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM), que permite obter um cromatograma livre de interferências – Figura 7, monitorando somente o íon filho de um íon pai específico (obtido em MS/MS – triplo quadrupolo com célula de colisão).

Figura 6. Resultados de MRM com o fragmento a ser monitorado para a análise qualitativa e o fragmento para análise quantitativa.
Figura 7. Exemplo da melhoria de seletividade e sensibilidade obtida no modo MRM.

Entre as desvantagens do uso da espectrometria de massas pode-se citar:

  • custo do equipamento e custo operacional mais alto
  • necessidade de condições adicionais especiais (gases ou solventes mais puros, colunas mais eficientes e resistentes, melhoria no preparo de amostra, redução nos volumes de injeção, restrição de uso de alguns aditivos e solventes típicos de cromatografia)
  • uso de bombas de alto vácuo (10-5 a 10-7 Torr)
  • maior manutenção
  • maior treinamento
  • maior tempo de desenvolvimento de método
  • mais itens de validação de métodos
  • perda de intensidade de sinal, principalmente no caso de triplo quadrupolo devido ao caminho maior dos íons gerados

Informações mais detalhadas estão disponíveis em nossos cursos de HPLC e no curso de GC Avançado (cromvallab.com)

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Dra Glaucia Maria F. Pinto

VOCÊ SABE O QUE É MIXED-MODE STATIONARY PHASE?

São fases estacionárias que permitem múltiplas interações (no mínimo com 2 tipos de mecanismos de retenção diferentes com o analito).

Elas dão origem a diversas aplicações do que ficou conhecido como MM-HPLC e permitem obter separações diferenciadas, com excelente seletividade.

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Dra. Glaucia Maria F. Pinto

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS PARA CONTROLES AMBIENTAIS

As técnicas cromatográficas, HPLC, GC, LC-MSMS, LC-MS, GC-MS, nunca estiveram tão em destaque quanto nos dias atuais.

Na indústria farmacêutica, cosmética e alimentícia as técnicas cromatográficas dominam, afinal essas técnicas permitem monitorar os padrões de qualidade de matérias primas e produtos acabados, incluindo perfis de impurezas e degradação nos testes de estabilidade.

Porém, na área ambiental as técnicas de cromatografia líquida e à gás também são cada vez mais requisitadas devido ao poder de separação em conjunto com a possibilidade de análise qualitativa e qualitativa de analitos presentes em matrizes complexas.

Cromatografia e preparo de amostra

Com a publicação da Portaria GM/MS nº 888 de 4 de maio de 2021, que  foi publicada em 7 de maio de 2021, essa necessidade de métods cromatográficos cada vez mais eficientes e que permitam alcançar limites de detecção e de quantificação cada vez menores, se tornou mais evidente e consolidade.

A portaria 888/2021 dispõe sobre os procedimentos de controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade e inclui desafios, como:

  • Parâmetros físicos
  • Parâmetros microbiológicos
  • Cianotoxinas
  • Metais => métodos de EAA e ICP
  • 10 subprodutos: 3 novos, incluindo NDMA => métodos cromatográficos
  • 16 substâncias orgânicas => métodos cromatográficos
  • 57 agrotóxicos e metabólitos => métodos cromatográficos

Como escolher a melhor técnica cromatográfica para atender os parâmetros da portaria?

Amostra de água.

Veja também um vídeo sobre o comparativo entre as técnicas e verifique qual técnica pode atender melhor a sua necessidade.

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Como escolher a membrana filtrante para sua amostra de HPLC?

São tantas as preocupações e necessidades de conhecimento na área de HPLC!!!

🤨 Devemos filtrar as nossas amostras, para prevenir contaminações, aumentar a vida útil da coluna e melhorar a qualidade da análise, MAS é necessário escolher bem a membrana de filtração a ser utilizada.

🤔 Algumas membranas podem ser incompatíveis com o meio (solvente/diluente da amostra), podem possuir substâncias que serão extraídas (comportando-se como fonte de contaminação) e podem se ligar aos analitos devido a afinidades e forças de interação.

Veja no post alguns estudos e comparativos. Espero que seja útil!

E não esqueça de validar o uso do seu filtro de amostra e definir o volume de saturação da membrana! 🧡💛💚💙

Para saber mais sobre cromatografia e HPLC nos siga nas redes sociais (YouTube, Instagram e Linkedin).

Temos vários cursos online e com aulas práticas presenciais, nas quais realizamos o preparo da amostra até o processamento de dados. A próxima data da aula prática será em 27 de novembro de 2021!

Escreva cromvallab@gmail.com

Aguardo vocês em outros posts e cursos.

Abraços,

Glaucia Maria F. Pinto

RESUMO SOBRE OS GASES EMPREGADOS EM CROMATOGRAFIA A GÁS

Na cromatografia a Gás, um dos fatores mais importantes é garantir o uso de um gás inerte, puríssimo e compatível com o detector.

Não são muitas as opções (hidrogênio, hélio, nitrogênio, metano e argônio), e, geralmente, na prática optamos por nitrogênio e hélio. Mas como devemos escolher?

Além do uso do gás como substituinte da fase móvel, como gás de arraste, também é importante considerar o tipo e vazão do gás usado como Make up (make up gas) no detector. O uso adequado deste reduz o alargamento de banda e pode aumentar a sensibilidade.

Veja abaixo algumas considerações a respeito dos gases para a boa performance de operação do cromatógrafo à Gás.

Para esclarecer outras dúvidas ou realizar um treinamento em CG escreva: cromvallab@gmail.com

O que fazer quando a coluna cromatográfica não apresenta o resultado e desempenho esperado? Descartar ou regenerar?

Toda coluna cromatográfica apresenta uma vida útil, que em geral, é muito variável e dependente das condições operacionais as quais ela é submetida.

O custo da coluna é relativamente alto, em relação ao custo da análise, principalmente em HPLC e, portanto, deve-se garantir a melhor vida útil possível para as colunas (sobre este assunto veja o post: https://cromvallab.com/2021/07/24/hplc-trobleshooting-os-mais-comuns-as-principais-causas-e-as-melhores-solucoes/ e o vídeo: https://youtu.be/zrRM320O5G8).

Apesar de todos os cuidados, eventualmente, aquela análise que estava adequada no dia anterior pode apresentar, no dia seguinte, picos deformados, com alteração do tempo de retenção, problemas de quantificação e etc e isso pode ocorrer devido a contaminações e retenções de substâncias da matriz da amostra (ou impurezas da fase móvel e aditivos) na fase estacionária da coluna.

Uma coluna pode voltar a apresentar seus resultados ótimos se executada uma limpeza e regeneração adequada e saber realizar este processo é importantíssimo!

Veja abaixo algumas dicas para livrar a sua coluna de contaminantes e retenções indesejadas. Ela pode durar muito mais!

Gostou das dicas? Quer saber mais a respeito de cromatografia e HPLC?

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