O que é Dwell Volume e Dead Volume e como eles interferem no desenvolvimento ou transferência do seu método por HPLC?

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

O dwell volume, que pode ser traduzido como tempo de permanência, representa o volume entre a câmara de mistura de fase móvel (conhecido como misturador) e a entrada da coluna cromatográfica. Cada equipamento tem um dwell volume, dependendo do misturador e se a mistura ocorre a baixa ou alta pressão. Veja na Figura 1 uma representação ilustrando a diferença de dwell volume.

Figura 1. Representação do dwell volume em dois diferentes tipos de sistemas: com misturas à alta pressão (sistemas de bombas binárias) e com misturas à baixa pressão. Observe que o dwell volume é maior em sistemas com misturas de fase móvel à baixa pressão, mas este valor também depende do volume do misturador presente no sistema.

O dwell volume inclui o volume da câmara de mistura de solventes de fase móvel, o volume das tubulações (do misturador até a bomba e da bomba até o injetor e do injetor até a entrada da coluna); a bomba com suas cabeças e check valves e o injetor (no caso de sistemas à baixa pressão – que são os mais comuns).

Portanto, como o dwell volume varia nos sistemas cromatográficos, ele interfere no resultado de um método descrito com a utilização de gradiente ou em métodos nos quais a eluição é isocrática mas a composição é preparada na bomba do HPLC (interferência menor).

No caso de eluição por gradiente, o dwell volume altera o delay time (tempo de atraso da mistura no gradiente) e portanto é possível que um método executado em diferentes equipamentos mostrem resultados de separação bem distintos (pois a composição da FM na coluna será diferente, alterando a resolução visualizada).

A Figura 2 ilustra a diferença deste volume em relação a 2 equipamentos importantes na área de cromatografia líquida.

Figura 2. Comparativo entre o dwell volume entre os equipamentos Agilent 1100 e Alliance (Waters).

Esta diferença de volume ilustra que se houver uma transferência de método envolvendo esses dois equipamentos citados na Figura 2, o resultado será diferente e o dwell volume deverá ser corrigido, corrigindo-se o tempo do gradiente (o dead volume ou void volume dos sistemas também poderá influenciar, principalmente causando alargamento de banda, como será visto a baixo).

Se o dwell volume é diferente, os tempos de retenção e as resoluções serão diferentes (as larguras de pico também podem variar), utilizando equipamentos distintos, mesmo com o mesmo método e a mesma coluna.

A Tabela 1 apresenta o comparativo entre os dwell volume (VD) para diferentes equipamentos de cromatografia da Waters.

A Figura 3 apresenta um resultado cromatográfico evidenciando a diferença de tempo de retenção devido diferentes VD.

Figura 3. Cromatograma comparativo obtido em equipamentos com diferentes dwell volume (mudança no tempo de retenção).

A Figura 4 ilustra a mudança de resolução entre picos em situações nas quais o dwell volume varia.

Figura 4. Impacto de diferentes dwell volumes na resolução.

Dwell volume x dead volume (void volume)

O volume morto não pode ser confundido com o dwell volume!

O volume morto (ou volume extra coluna) representa qualquer volume adicional, como pequenos espaços em conexões malfeitas, volumes adicionais causados por tubulações de comprimento ou diâmetro maior que o ideal e até mesmo canais ou espaços abertos no recheio da coluna devido a degradação do suporte da fase estacionária.

A Figura 5a ilustra o volume morte devido a conexões, um dos principais problemas relacionados com alargamento e distorção de banda, especialmente em sistemas de UPLC. A Figura 5b ilustra como o pico cromatográfico pode ser distorcido ou alargado ou ficar com caudas devido a volumes mortos no sistema.

Figura 5a. Conexões malfeitas (em a causando vazamento, em b causando volume morto) e conexão ideal em c.

Figura 5b. Ilustração da banda cromatográfica sendo eluida e sofrendo alargamento devido a existência de volume adicional no caminho, causando cauda e alargamento no pico.

A Figura 6 apresenta um cromatograma de exemplo de resultado ideal desejável e de picos com distorções causadas por volume morto no sistema.

Figura 6. Cromatograma comparando resultados obtidos com conexões ideais e conexões que causam cauda nos picos.

A diferença nos volumes de célula de detectores UV também podem representar uma diferença nos resultados cromatográficos, pois o volume da célula do detector pode contribuir para uma redução de eficiência e, portanto, de resolução de picos, pois contribuem também para alargar a banda cromatográfica (mesmo que em pequena extensão).

A Tabela 2 apresenta uma comparativo entre volumes de célula de detector de diferentes equipamentos Agilent e a Figura 7 ilustra a diferença entre a resolução de picos obtidos com o mesmo método e a mesma coluna, porém em equipamentos com diferentes volumes de célula de detector.

Tabela 2

Figura 7. Resultado cromatográfico comparativo: célula de detector com menor volume permite obter melhores resoluções entre os picos.

Como calcular o dwell volume?

Quando o gradiente se inicia, a coluna demora para receber a proporção real do gradiente e este atraso (delay time) é proporcional ao dwell volume do equipamento.

O dwell volume é igual o tempo entre a injeção e a metade da altura do traço do pico, multiplicado pela vazão da fase móvel (fluxo), medido usando um gradiente.

Uma possibilidade simples para executar a medida é:

  • remover a coluna e usar um conector de volume morto zero ou um tubo capilar de 1m x 0,125 mm de diâmetro interno para conectar o injetor ao detector
  • utilize água grau HPLC no canal A e água grau HPLC + 0,1% de acetona no canal B
  • Utilize 265 nm para fazer a medida
  • Corra um gradiente de 0-100% de B durante 20 minutos, a 2 mL/min (ou um gradiente de 10 a 60 min a 1-2 mL/min)

O injetor deve ser usado pois também faz parte da medida do dwell volume. Pode ser injetada água grau HPLC para correr o gradiente.

Alternativamente, o canal B pode conter propil parabeno ou cafeína 10 mg/L (o comprimento de onda deve ser ajustado).

A Figura 8 representa o esquema da medida do dwell volume, utilizando a curva de gradiente obtida.

HPLC Solutions #86: Measuring Dwell Volume

Figura 8. Cálculo de delay time do gradiente e posterior conversão em dwell volume, multiplicando pela vazão de fase móvel.

Um exemplo de curva obtida ne medida pode ser vista na Figura 9.

Figura 9. Medida de dwell volume: neste exemplo o tempo de 50% do gradiente e o tempo de início do gradiente são 4,04 e 2,00 min, respectivamente.

Torna-se interessante também medir o volume morto e o alargamento de banda do sistema. Essas medidas podem ser realizadas usando um conector de volume morto zero, substituindo a coluna e uma substância que permita ter um bom sinal, como uma solução de cafeína. A Figura 10 ilustra essas medidas.

Figura 10. Medida de volume morto do sistema sem coluna e alargamento de banda.

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Já teve problemas com transferência de métodos entre equipamentos diferentes?

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Abraços!

Dra. Glaucia Maria F. Pinto

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