As técnicas cromatográficas ganharam destaque entre as técnicas analíticas devido a capacidade de separar diferentes constituintes presentes em matrizes complexas e, em teoria, permitir análise qualitativa e quantitativa de cada componente da mistura (amostra). Para análise qualitativa básica comparamos os tempos de retenção do padrão com o tempo de retenção do pico na amostra, considerando que as afinidades e interações permitem diferenciar diferentes estruturas químicas (mas isso é apenas uma aproximação, pois podem existir coincidências). Para a análise quantitativa comparamos a área ou a altura dos picos da amostra com as áreas ou a altura dos respectivos picos do padrão., obtidos nas mesmas condições, com os mesmos detectores.
Obviamente, várias condições são necessárias para atender os objetivos: desenvolvimento do melhor método (escolha de colunas, fases estacionárias, fases móveis, preparo de amostra, etc), escolha do equipamento e parâmetros operacionais adequados, uso de padrões e substâncias químicas de referência, tratamentos de dados e processamento.
Para uma boa análise tudo é importante! Mas precisamos de um bom cromatograma, gerado com um detector apropriado. A Figura 1 ilustra o resultado diferente obtido para a mesma amostra injetada utilizando dois detectores diferentes na análise de HPLC: um detector de arranjo de diodos (PDA – photodiodo array) e um detector de espalhamento de luz evaporativo (ELSD – evaporative light scattering detector).
A Figura 2 ilustra a análise de uma amostra empregando 3 diferentes tipos de detectores de cromatografia a gás: detector de ionização em chama (FID – flame ionization detector), detector termiônico de chama (FTD – flame thermionic detector) e detector fotométrico de chama (FPD – flame photometric detector).
Detectores mais seletivos são mais sensíveis e permitem quantificação de concentrações mais baixas (atingem menores limites de detecção e quantificação). Porém, os detectores quanto mais seletivos mais irão “filtrar” os compostos a serem analisados de acordo com a propriedade físico química capaz de ser medida (menor quantidade de picos cromatográficos serão visualizados).
E os detectores de massas?
O acoplamento da cromatografia com a espectrometria de massas ampliou as opções e a confiabilidade das análises cromatográficas. Tendo o espectrômetro de massas como detector é possível realizar a confirmação da identidade de cada pico cromatográfico (extraindo os respectivos espectros de massas), quantificar os compostos e eventualmente eliminar interferentes da matriz ou co-eluições obtendo cromatogramas considerando massas/cargas específicas (no caso de utilizar MS/MS, muito útil na análise de baixas concentrações em matrizes complexas).
Assim, as principais vantagens do uso de espectrômetros de massa como detectores de cromatografia:
- ser um detector universal
- possibilidade de confirmação de identidade (análise qualitativa inequívoca utilizando o espectro de massa)
- possibilidade de identificação de compostos mesmo sem o uso de padrões
- possibilidade de quantificar sem falsos positivos
- possibilidade de realizar a deconvolução de picos não separados (utilizando as massas/cargas)
- possibilidade de eliminar interferentes da matriz e co-eluições (no caso de MS/MS – triplo quadrupolos)
- aumentar a sensibilidade e seletividade do método
- calcular pureza de pico cromatográfico
A Figura 3 ilustra um cromatograma obtido por GC-FID e GC-MS, comparativamente. Neste caso evidencia-se a possibilidade de obtenção de resultados muito similares com os dois detectores. Porém, com o detector de massas torna-se possível identificar os picos, mesmo sem o uso de padrões, obtendo os respectivos espectros de massas e utilizando bibliotecas disponíveis, ou confirmar a identidade dos picos com tempos de retenção coincidentes com padrões específicos utilizados, ou ainda verificar a pureza de cada pico eluido e descartar co-eluições comparando os espectros de massas extraídos em regiões diferentes do mesmo pico, melhorar a sensibilidade obtendo o cromatograma monitorando íons específicos e etc.
A Figura 4 ilustra o processo de deconvolução de espectros de massas para separação de picos não separados.
A Figura 5 mostra um cromatograma e os respectivos espectros de massa extraídos para cada pico.
A Figura 6 demonstra um resultado obtido no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM), que permite obter um cromatograma livre de interferências – Figura 7, monitorando somente o íon filho de um íon pai específico (obtido em MS/MS – triplo quadrupolo com célula de colisão).
Entre as desvantagens do uso da espectrometria de massas pode-se citar:
- custo do equipamento e custo operacional mais alto
- necessidade de condições adicionais especiais (gases ou solventes mais puros, colunas mais eficientes e resistentes, melhoria no preparo de amostra, redução nos volumes de injeção, restrição de uso de alguns aditivos e solventes típicos de cromatografia)
- uso de bombas de alto vácuo (10-5 a 10-7 Torr)
- maior manutenção
- maior treinamento
- maior tempo de desenvolvimento de método
- mais itens de validação de métodos
- perda de intensidade de sinal, principalmente no caso de triplo quadrupolo devido ao caminho maior dos íons gerados
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Dra Glaucia Maria F. Pinto
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