Um pouco mais sobre a cromatografia de convergência (CC) – APLICAÇÕES

Autor: Igor M. Santana, M.Sc. , Pesquisador a nível doutorado, Departamento de Química Analítica, Instituto de Química da Unicamp

Em um post anterior (que pode ser lido clicando aqui: https://cromvallab.com/2020/09/12/voce-conhece-a-cromatografia-convergente-e-a-cromatografia-unificada/o aqui), foi falado da cromatografia de convergência (CC) e suas diferenças para as tradicionais cromatografia líquida (LC) e gasosa (GC). Nesse post, detalharemos um pouco mais sobre essa técnica que surgiu no começo dos anos 60, mas não alcançou a mesma popularidade de LC e GC. A CC também pode ser conhecida pelo seu nome popular, cromatografia com fluido supercrítico (ou SFC). Por isso, é preciso primeiro entender o que é um fluido supercrítico e como suas propriedades aplicam-se à cromatografia.

O fluido supercrítico está em uma condição de pressão e temperatura na qual líquido e gás coexistem, mas sem haver uma separação entre eles. Por exemplo, a água em ebulição: é possível ver onde o líquido termina e onde o vapor começa, através da formação de bolhas, condição na qual chamamos de separação de fases. Em um fluido supercrítico, as propriedades do líquido e do gás, como densidade e viscosidade, convergem a tal ponto em que se tornam uma fase só (Figura 1). Em outras palavras, as propriedades de um fluido supercrítico são intermediárias às de um líquido e de um gás, principalmente sua densidade e viscosidade, importantes para processos cromatográficos.

      Figura 1. Transformação do CO2 em um fluido supercrítico (sem a separação de fases líquido-gás) ao aumentar a pressão e temperatura.

      Hoje, o principal fluido usado é o CO2 por apresentar condições críticas (pressão e temperatura) brandas em comparação a outras substâncias. Porém, como o CO2 é uma substância muito apolar, é necessário misturá-lo com modificadores polares (como metanol) para ter força suficiente para eluir compostos mais polares, que costumam ser mais retidos na fase estacionária com essa técnica. A adição de modificadores orgânicos altera as propriedades do fluido, principalmente a temperatura crítica, e parte do processo de separação ocorre em uma condição abaixo dessa temperatura, sendo chamada de subcrítica. No entanto, na prática não há diferença significativa entre as condições supercrítica e subcrítica desde que as propriedades do fluido permaneçam contínuas, ou seja, sem separação de fases (é por isso que a instrumentação em SFC requer um item a mais que um instrumento de HPLC tradicional, chamado de regulador de pressão de retorno ou backpressure regulator, BPR) [1]. Como consequência, o termo “supercrítico” não é mais adequado para designar essa técnica cromatográfica, permanecendo apenas por motivos históricos. A característica mais marcante é a compressibilidade do fluido, ou seja, maior sensibilidade a mudanças de pressão e temperatura em comparação a uma fase puramente líquida. O nome cromatografia de convergência (CC) usado pela Waters é pertinente, pois a fase móvel pode convergir nos estados supercrítico, subcrítico (mais comum) e líquido em uma única corrida.

A principal aplicação da CC tem sido na resolução enantiomérica de fármacos, de forma que é vista como substituta ideal para métodos compendiais que empregam cromatografia líquida em fase normal (NPLC). A NPLC emprega solventes agressivos ao meio ambiente (como derivados de petróleo e solventes clorados), tem equilíbrio lento com a fase estacionária e não tem compatibilidade com espectrometria de massas (MS). Por sua vez, o fluido usado em CC (predominantemente CO2 pressurizado) é ecologicamente mais amigável (não inflamável e não tóxico), além de ser mais barato. Além disso, a viscosidade do fluido é muito menor, o que resulta em corridas de 3 a 5 vezes mais rápidas. Como a maior parte da fase móvel é um gás em pressão ambiente, seu acoplamento com MS é facilitado. Por exemplo, o método USP para análise de tolazamida, um fármaco redutor de glicemia, emprega NPLC com grande consumo de hexano, de origem fóssil. O tempo total de análise chega a 30 minutos, a uma vazão de 1,50 mL/min com uma coluna Agilent Zorbax RX-Sil 4,6 x 250 mm, partículas de 5 µm, gerando um resíduo de 43 mL somente de hexano. Sua substituição por SFC reduz o tempo total de análise para 5,5 minutos com a mesma coluna, mas com uma vazão de 3 mL/min. A Figura 2 apresenta os cromatogramas e o resultado para o system suitability, mostrando que ambos os métodos atendem ao critério USP [2]. No caso de SFC, o consumo total de solvente chegou a 16,5 mL, mas gerou apenas 1,0 mL de resíduo para ser tratado, pois a maior parte da fase móvel (CO2) evapora ao fim da análise. Esse caso mostra a nítida economia de tempo (e financeira), que pode ser obtida também em outros métodos onde NPLC ainda é empregada.

Figura 2. Comparação entre métodos NPLC e SFC para tolazamida com base em critérios USP. Adaptado da referência 2.

Outra aplicação vantajosa da CC é a separação ortogonal em comparação à cromatografia líquida em fase reversa (RPLC). A RPLC é o modo cromatográfico mais empregado em indústrias farmacêuticas, porém, falha em obter boas retenções de compostos polares. Agências regulatórias têm exigido o controle de produtos de degradação de IFAs (possíveis metabólitos), os quais costumam ser mais polares, dificultando a sua quantificação por RPLC, ou com estruturas muito similares, apresentando baixa resolução. Uma alternativa é o uso de NPLC ou de cromatografia por interação hidrofílica (HILIC), técnicas ortogonais à RPLC.

Além das desvantagens já discutidas de NPLC, a HILIC depende de grande quantidade de acetonitrila, um solvente mais caro, além de requerer maior tempo de equilíbrio quando eluições gradientes são empregadas, demandando mais tempo por análise. A retenção de compostos apolares também é menor nesse modo. A CC é uma opção viável a estas técnicas por apresentar comportamento ortogonal: a fase móvel é apolar (ao contrário de RPLC e HILIC), e a fase estacionária pode ser tanto polar (sílica, usada em HILIC) como apolar (C18, usada em RPLC). A aplicação direta dessas características é a possibilidade de se obter perfis cromatográficos complementares com apenas duas corridas (uma em CC e outra em RPLC, por exemplo), permitindo ver o maior número de picos com o menor número de alteração experimental (como pH ou fases estacionárias). No exemplo da Figura 3, realizou-se um estudo de produtos de degradação da ondansetrona (medicamento usado para reduzir efeitos de tratamentos quimioterápicos), porém dois produtos (impurezas E e F, mais polares) não foram retidos em nenhuma condição RPLC [3]. O método empregando CC conseguiu reter as impurezas E e F o bastante para quantificá-las em um intervalo de tempo semelhante. No entanto, o IFA e a impureza A coeluem, embora a detecção com espectrometria de massas consiga selecioná-las individualmente. Note também que as impurezas C e D, que são mais retidas no método RPLC, são compostos menos retidos no método CC, evidenciando a seletividade ortogonal de ambas as técnicas cromatográficas.

Figura 3. Comparação da seletividade ortogonal de RPLC com CC para análise de ondansetrona e seus produtos de degradação. Adaptado da referência 3.

Embora a CC seja bem estabelecida em indústrias farmacêuticas, ainda é nítida a resistência que existe no Brasil em introduzir essa técnica no rol analítico. Talvez os principais embargos sejam a aquisição inicial (mais caro que instrumentos UPLC) e a necessidade de mais treinamentos por tratar-se de um modo cromatográfico não convencional (porém, na prática, o usuário de HPLC logo percebe que a operação é similar). Apesar do custo inicial, a alta produtividade e baixa geração de resíduos, além de propriedades complementares à RPLC, tornam a CC economicamente viável a longo prazo. Ainda, essa técnica é complementar a muitos outros modos de HPLC a partir de modificações simples na fase móvel (enquanto as características de outros modos cromatográficos são drasticamente distintas, como RPLC e NPLC, dificultando análises ortogonais). A Figura 4 mostra um resumo simplificado dessa complementaridade [4].

Figura 4. Comparação entre SFC (ou CC) e diferentes modos de cromatografia líquida. A CC é uma opção complementar interessante à LC. Adaptado da referência 4.

Autor: Igor M. Santana, M.Sc.

Pesquisador a nível doutorado

Departamento de Química Analítica

Instituto de Química da Unicamp

Contato: http://lattes.cnpq.br/0702244403546739

Referências

  1. Terry A. Berger, “The past, the present and the future (?) of analytical supercritical fluid chromatography – a 2018 perspective”, Chromatography Today (2018), pp 4-8 (disponível em: https://www.chromatographytoday.com/article/supercritical-fluid-sfcgreen-chromatography/45/sfc-solutions-inc/the-past-present-and-future-of-analytical-supercritical-fluid-chromatography-ndash-a-2018-perspective/2428). Acessado em 01 de fevereiro de 2021.

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