Existem segredos para processar e integrar picos cromatográficos?

A cromatografia, e principalmente a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), está presente no dia a dia de vários laboratórios e analistas. Ao mesmo tempo poderosa, versátil, flexível e complexa!

Dominar a rotina básica de aquisição de dados cromatográficos é relativamente simples, porém, mesmo os mais experientes analistas sabem que o HPLC também pode ser uma “caixinha de surpresas” e de novos desafios diários relacionados com desenvolvimento de métodos e troubleshooting.

Vencidos os possíveis empecilhos para iniciar uma aquisição de dados, a etapa mais importante e trabalhosa se concentra em estabelecer o melhor processamento dos resultados e a melhor integração de picos cromatográficos, pois o tipo de integração irá impactar no resultados real a ser obtido na análise cromatográfica.

Obviamente, quanto melhor for realizado o desenvolvimento do método de separação em si, isto é, quanto melhor estabelecidos estiverem os parâmetros de separação das substâncias presentes na mistura, mais rápido e assertiva será a integração dos picos. Se o método estiver permitindo obter picos bem separados, de área e altura adequados em relação ao ruído, mais simples será a integração (dependendo apenas da determinação dos melhores valores de threshold e peak width). A Figura 1 exemplifica como a escolha correta dos valores de peak width e threshold (também conhecido como slope sensitivity) são importantes. Lembre-se também que o valor de peak width medido para o menor pico do cromatograma deve ser utilizado para definir a taxa de aquisição de pontos, na aquisição de dados (mantendo o valor de 15 a 20 pontos por pico como um valor ideal).

Figura 1. Ilustração da importância da escolha dos valores adequados de peak width e threshold. Note que com valores muito altos ou muito reduzidos os picos são integrados de forma errada ou não são detectados.

A Figura 2 abaixo ilustra a separação de picos cromatográficos:

  • A primeira ilustração representa uma separação excessiva entre as substâncias, o que acarretará um tempo de análise maior que o necessário
  • A segunda ilustração representa uma separação ideal, com resolução adequada
  • A terceira ilustração representa uma separação não adequada, com picos com pouco separação, co-eluindo e mantendo uma zona de mistura entre os dois compostos que podem ser identificados. Estes picos são chamados de picos fundidos e a maior variação de resultados, devido a diferentes possibilidades de integração, ocorrem com esta categoria de picos.
  • A quarta ilustração não pode ser aceita, pois a co-eluição é praticamente completa, com uma zona de mistura praticamente completa entre os compostos.
Figura 2. Ilustração demonstrando a separação de picos desejada.

E quais são as possibilidades de métodos de integração de picos fundidos, como os ilustrados na Figura 2?

A Figura 3 mostra as principais opções de tipos de integração de picos fundidos.

Figura 3. Principais tipos de integração.

A escolha da melhor integração depende de algumas características e objetivos, mas deve-se considerar que é imprescindível que tanto padrão como amostras sejam processados com o mesmo método para reduzir os erros dessas integrações de picos fundidos, que já são mais sujeitos a erros e variações.

A Figura 4 ilustra um exemplo do poder de ajuste que o algoritmo ApexTrack possui.

Figura 4. Exemplos da habilidade de integração que o algoritmo ApexTrack possui.

A Figura 5 apresenta um exemplo do uso do i-PeakFinder, do LabSolution (Shimadzu), completamente automatizado.

Figura 5. Exemplo de integrações automáticas obtidas pelo algoritmo i-Peak Finder do LabSolution (Shimadzu).

O CDS Chromeleon, da Thermofisher, também possui ferramentas para auxiliar na tarefa de integrar picos adequadamente. O algoritmo Cobra e o assistente de integração chamado SmartPeaks são responsáveis pelo auxílio. A Figura 6 demonstra a funcionalidade dessas ferramentas.

Figura 6. Opções de integração do Assistente SmartPeaks.

O artigo disponível no link: Integration Errors in Chromatographic Analysis, Part I: Peaks of Approximately Equal Size (chromatographyonline.com) discute, com valores experimentais obtidos, os vários tipos de erros encontrados utilizando as diferentes integrações de picos, em diferentes proporções de áreas entre picos com pequena resolução.

De forma geral, os erros de integração são praticamente ausentes com resoluções de 2,0 ou mais. Quando as integrações são similares em resultados obtidos, o método de drop integration será então o mais conveniente.

Para resoluções entre 1,5 e 1,0, tanto o método drop ou Gaussian Skim produzem os menores erros se os 2 picos vizinhos tiverem aproximadamente o mesmo tamanho (o pico menor pode ser no máximo 5% menor apenas). O método de valley to valley conduz aos maiores erros negativos, principalmente para pequenos picos. O método exponential skim pode ser inválido para estes casos e conduz a erros negativos significantes para sholder peaks (ombros). Em geral, nesta situação, as medidas de altura levarão a erros menores do que as medidas de áreas. Portanto, o drop method usando altura pode ser a melhor escolha. Uma integração com método Gaussian Skim também pode ser uma escolha aceitável, entretanto, este ainda é um método relativamente mais novo e vários software ainda estão se adaptando.

Assim, como conclusão final, retornamos a Figura 2, pois para reduzirmos os erros de integração, de fato, deve-se priorizar métodos com resolução maior que 2,0. No caso de picos com tamanhos similares é possível aceitar resoluções da ordem de 1,5 e com escolhas de métodos de integração melhores ainda encontrar erros de magnitude aceitável. Porém, resoluções da ordem de 1,0 devem ser evitadas pois o aumento nos erros de integração são significativamente maiores, mesmos com os melhores métodos de integração.

Veja a Figura 7 como exemplo/ilustração das diferenças de métodos de integração em diferentes proporções de tamanho de picos.

Figura 7. Com resoluções abaixo de 1,5 a escolha do método de integração de picos adjacentes deve ser cautelosa, levando em consideração a diferença de tamanho dos picos.

Espero que tenham gostado do post, lembrando que uma discussão sobre o assunto será abordada em nossa Live do dia 22 de julho de 2021 (no canal da Cromvallab no Youtube) e o vídeo ficará disponível.

Observações:

  1. Este assunto é parte integrante do nosso Curso Dominando os Principais CDS Empower e OpenLab e teremos uma aula adicional com aprofundamento e discussão dos algoritmos tradicionais de integração e ApexTrack em breve
  2. No curso Operação de HPLC: do zero ao 100% o processamento e integração de picos cromatográficos são discutidos e exemplificados na prática, utilizando o OpenLab e Empower.

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Abraços!!!

Dra. Glaaucia Maria F. Pinto

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