Como devemos calcular o volume de injeção máximo a ser utilizado em colunas de HPLC e UHPLC?

Devemos nos preocupar com o volume de amostra  a ser injetado e também com a massa de soluto por massa de fase estacionária a ser utilizado no HPLC.

Estes parâmetros devem ser definidos de acordo com as características da coluna a ser empregada no método de análise.

Sobrecarga de amostra na coluna (2 mg/g de fase) resulta em decréscimo de eficiência, decréscimo de retenção e aumento de cauda, mas em geral é muito difícil conhecer a massa de fase estacionária em colunas analíticas de HPLC e a tendência será sempre trabalhar com amostras bem diluídas.

Assim, volumes de injeção ótimos são diretamente relacionados com o volume da coluna, que deve ser calculada pela área transversal e comprimento da coluna:

Ilustração esquematizando como calcular o volume da coluna cromatográfica a partir de seu diâmetro e comprimento.

Para obter as melhores resoluções e eficiências devemos trabalhar com volumes ótimos de injeção de amostra.

A Figura 1 exemplifica o efeito na qualidade do cromatograma quando se trabalha com volumes excessivos de amostra.

Figura 1a e 1b. Comparativos do efeito de redução no volume de injeção de amostra permitindo obter melhores eficiências, resoluções e reduzindo a assimetria do pico cromatográfico.

O volume máximo de amostra depende: área superficial do suporte, % de recobrimento, fator de retenção dos picos, resolução, volume da coluna;

Volume máximo de injeção deve ser < 1% do  volume interno da coluna vazia.

No caso de uma coluna de 2,1 mm x 5 cm:

V= π.r².L= π.(2,1/2)².50= 173 mm³ volume da coluna

V max= 0,01×173= 1,7 mm³= 1,7 µL

O volume Ideal de injeção versus dimensão da coluna

Nós podemos estimar o volume de injeção apenas com as dimensões da coluna, considerando o mesmo material de empacotamento. Nesta aproximação o diâmetro da coluna é o fator limitante.

Veja a tabela abaixo com os volumes de injeção típicos em função do diâmetro da coluna.

Diâmetro da ColunaVolume (µL)
2,1 mm (30 -100 mm comprimento)1-3
3,0-3,2 mm (50-150 mm comprimento)2-12
4,6 mm (50-250 mm comprimento)8-40
10 mm (50-250 mm comprimento)40-100
21,2 mm (50-250 mm comprimento)150-300
30 mm (50-250 mm comprimento)300-700
50 mm (50-250 mm comprimento)1000-2000

Volumes de injeção grandes podem ser aceitáveis se os picos são ainda simétricos (a vantagem é permitir melhores sensibilidades)

Compostos que eluem mais rápido irão exibir alargamento se o volume for muito alto.

Se o solvente na sua amostra é mais forte do que a fase móvel será necessário usar um volume de injeção menor.

Por outro lado, se o solvente de sua amostra for mais fraco do que a fase móvel, você poderá usar um volume maior de injeção.

  • Se a amostra for preparada com solvente mais forte que a FM diminui-se a eficiência e o fator de retenção;
  • Sempre que possível deve-se preparar a amostra em FM ou em solvente mais fraco;
  • Exemplo: FM com 30% de metanol, amostra deve ser dissolvida em no máximo 30% de metanol. 30% de acetonitrila não é adequado

Para maiores detalhes sobre força de fase móvel veja o post: Vamos falar sobre fase móvel de HPLC e força cromatográfica no desenvolvimento de métodos? – CROMVAL Lab – Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão

Porque vale a pena reduzir as dimensões das colunas (comprimento e diâmetro) e tamanhos de partículas?

Principalmente porque a melhor resolução e eficiência obtidas permitem reduzir os tempos de análise e economizar fase móvel também.

O comparativo abaixo foi calculado utilizando uma ferramenta disponibilizada pela Sigma Aldrich. Na simulação se evidencia a economia de tempo e solvente de acordo com a redução de comprimento (de 15 para 5 cm), diâmetro de coluna (de 4,6 para 2,1 mm) e tamanho de partícula (de 5 para 3 µm) e a correspondente redução no volume de injeção (de 20 para 1,4 µL).

Ferramenta da Sigma Aldrich que permite calcular os respectivos volumes de injeção, vazão de fase móvel e outros ajustes de acordo com a mudança de dimensões da coluna cromatográfica e partícula de fase estacionária, evidenciando a economia de tempo de análise e solvente
(https://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/method-transfer-calculator.html)

Portanto, na transferência de métodos de HPLC para UHPLC, utilizando colunas de menores diâmetros e comprimentos deve-se lembrar de calcular os respectivos volumes de injeção adequados, para permitir a obtenção dos melhores resultados e o volume de injeção acaba sendo também importante no desenvolvimento de métodos na tentativa de alcançar as melhores performances.

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Dra. Glaucia Maria Ferreira Pinto

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