Devemos nos preocupar com o volume de amostra a ser injetado e também com a massa de soluto por massa de fase estacionária a ser utilizado no HPLC.
Estes parâmetros devem ser definidos de acordo com as características da coluna a ser empregada no método de análise.
Sobrecarga de amostra na coluna (2 mg/g de fase) resulta em decréscimo de eficiência, decréscimo de retenção e aumento de cauda, mas em geral é muito difícil conhecer a massa de fase estacionária em colunas analíticas de HPLC e a tendência será sempre trabalhar com amostras bem diluídas.
Assim, volumes de injeção ótimos são diretamente relacionados com o volume da coluna, que deve ser calculada pela área transversal e comprimento da coluna:
Para obter as melhores resoluções e eficiências devemos trabalhar com volumes ótimos de injeção de amostra.
A Figura 1 exemplifica o efeito na qualidade do cromatograma quando se trabalha com volumes excessivos de amostra.
O volume máximo de amostra depende: área superficial do suporte, % de recobrimento, fator de retenção dos picos, resolução, volume da coluna;
Volume máximo de injeção deve ser < 1% do volume interno da coluna vazia.
No caso de uma coluna de 2,1 mm x 5 cm:
V= π.r².L= π.(2,1/2)².50= 173 mm³ volume da coluna
V max= 0,01×173= 1,7 mm³= 1,7 µL
O volume Ideal de injeção versus dimensão da coluna
Nós podemos estimar o volume de injeção apenas com as dimensões da coluna, considerando o mesmo material de empacotamento. Nesta aproximação o diâmetro da coluna é o fator limitante.
Veja a tabela abaixo com os volumes de injeção típicos em função do diâmetro da coluna.
| Diâmetro da Coluna | Volume (µL) |
| 2,1 mm (30 -100 mm comprimento) | 1-3 |
| 3,0-3,2 mm (50-150 mm comprimento) | 2-12 |
| 4,6 mm (50-250 mm comprimento) | 8-40 |
| 10 mm (50-250 mm comprimento) | 40-100 |
| 21,2 mm (50-250 mm comprimento) | 150-300 |
| 30 mm (50-250 mm comprimento) | 300-700 |
| 50 mm (50-250 mm comprimento) | 1000-2000 |
Volumes de injeção grandes podem ser aceitáveis se os picos são ainda simétricos (a vantagem é permitir melhores sensibilidades)
Compostos que eluem mais rápido irão exibir alargamento se o volume for muito alto.
Se o solvente na sua amostra é mais forte do que a fase móvel será necessário usar um volume de injeção menor.
Por outro lado, se o solvente de sua amostra for mais fraco do que a fase móvel, você poderá usar um volume maior de injeção.
- Se a amostra for preparada com solvente mais forte que a FM diminui-se a eficiência e o fator de retenção;
- Sempre que possível deve-se preparar a amostra em FM ou em solvente mais fraco;
- Exemplo: FM com 30% de metanol, amostra deve ser dissolvida em no máximo 30% de metanol. 30% de acetonitrila não é adequado
Para maiores detalhes sobre força de fase móvel veja o post: Vamos falar sobre fase móvel de HPLC e força cromatográfica no desenvolvimento de métodos? – CROMVAL Lab – Cursos de especialização e profissionalizante: porque seu aperfeicoamento é nossa missão
Porque vale a pena reduzir as dimensões das colunas (comprimento e diâmetro) e tamanhos de partículas?
Principalmente porque a melhor resolução e eficiência obtidas permitem reduzir os tempos de análise e economizar fase móvel também.
O comparativo abaixo foi calculado utilizando uma ferramenta disponibilizada pela Sigma Aldrich. Na simulação se evidencia a economia de tempo e solvente de acordo com a redução de comprimento (de 15 para 5 cm), diâmetro de coluna (de 4,6 para 2,1 mm) e tamanho de partícula (de 5 para 3 µm) e a correspondente redução no volume de injeção (de 20 para 1,4 µL).
(https://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/hplc/method-transfer-calculator.html)
Portanto, na transferência de métodos de HPLC para UHPLC, utilizando colunas de menores diâmetros e comprimentos deve-se lembrar de calcular os respectivos volumes de injeção adequados, para permitir a obtenção dos melhores resultados e o volume de injeção acaba sendo também importante no desenvolvimento de métodos na tentativa de alcançar as melhores performances.
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Dra. Glaucia Maria Ferreira Pinto
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