COMO INICIAR UM DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO POR HPLC?

As técnicas cromatográficas são de suma importância nas diferentes áreas industriais e acadêmicas. Dentre os tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com certeza se destaca como a técnica mais versátil e portanto a de maior aplicação.

Porém, para obter uma boa condição de análise os métodos de HPLC necessitam de estudo e desenvolvimento. Condições de preparo de amostra, melhor coluna/fase estacionária, fase móvel, volume de injeção, detectores, entre outros, são alguns parâmetros a serem definidos para permitir separação eficiente e quantificação exata.


Por onde iniciar quando não temos uma referência de método completo?

1 – Pesquisa Bibliográfica:

Obter informações sobre o Analito e sobre a amostra. Principais perguntas:
A) O que eu preciso analisar absorve no UV ? Se não, terei que verificar outro detector. Se sim,  qual o melhor comprimento de onda?

Exemplo de espectro de absorção com 2 máximos: um no comprimento de onda de 255 nm e outro na região do visível, em 395 nm. Com a detecção nos máximos de absorção é possível obter as melhores sensibilidades.

B) Qual é o melhor solvente/ preparo de amostra? É necessário extração? Pré concentração? 


C) qual pka? Teremos que ajustar o pH ou trabalhar com par iônico? Troca iônica? (no caso de estar dissociada na forma de íons).

 D) Qual logP dos solutos?

Com esta informação podemos definir qual tipo de separação será melhor: – fase reversa: log P entre 5 a quase zero- fase normal: log P entre 0 e -1- HILIC: log P entre -1 a -4- troca iônica: log P menor que -4


B) sabendo qual o melhor tipo de separação podemos definir o tipo de FE a ser utilizada e já definiremos as características da FM compatível (que também tem que ser compatível com a amostra: deve-se testar a solubilidade).

Tipos de solventes para fase reversa e fase normal e triângulo de seletividade.

C) a escolha da coluna,  após escolher o tipo de FE, irá depender da rapidez desejada e eficiência necessária. Se houverem muitos picos a serem separados vale a pena investir em uma coluna de menor diâmetro e menor tamanho de partícula (mais caras).  Se o equipamento disponível for um UHPLC é possível trabalhar com coluna ainda mais eficientes (diâmetros e tamanho de partícula da ordem de 2 mm e 1,3 um, respectivamente).

Exemplos de algumas dos mais usados tipos de fases estacionárias.
Opções modernas de FE.
Exemplo da influência de algumas variáveis geométricas de colunas e eficiência obtida.
Alternativas mais modernas de FE.

Com certeza a modernização das fases estacionárias e colunas fez com que o HPLC/UHPLC conseguisse atingir novos patamares e permitiu se destacar em vários desafios, mas também tornou o desenvolvimento dos métodos mais delicado e com maior necessidade de estudo.

Outras definições de condições analíticas, como: vazão de fase móvel, temperatura e volume de injeção merecem atenção, mas acabam sendo definidas também de acordo com as características das e FE.

Precisa de ajuda no desenvolvimento? Gostaria de se aperfeiçoar nesta área?

Nos escreva: cromvallab@gmail.com

Abraços!

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