Como quantificar impurezas orgânicas e/ou produtos de degradação?

A definição do perfil de IMPUREZAS é a chave para assegurar a segurança, eficácia e qualidade de produtos farmacêuticos.

O perfil de impurezas mudou drasticamente nos últimos anos e se tornou um DESAFIO conhecer apropriadamente esse perfil

Guias, especificações e regulamentações surgiram, cada  vez mais exigentes e detalhadas.

Inicialmente o perfil de impurezas eram baseados em métodos simples, depois em estudos de degradação: o entendimento da estabilidade do fármaco, eficácia relacionada com as impurezas quirais e estereoisômeros foram incluídos, seguidos por métodos para solventes residuais, formas polimorfas e estudos de impurezas genotóxicas.

Tipos gerais de impurezas que podem ser encontradas em produtos farmacêuticos.

Impurezas orgânicas podem aumentar durante o processo de fabricação, devido a interações com excipientes e ativo e devido o armazenamento do insumo farmacêutico ativo (IFA) ou medicamento. As impurezas podem ser conhecidas ou desconhecidas, voláteis ou não voláteis. Em outras épocas as impurezas já foram identificadas e controladas com testes qualitativos como TLC e IR ou titulação. Atualmente, 80% dos fármacos são analisados utilizando técnicas cromatográficas para controlar as impurezas orgânicas.

Evolução das técnicas analíticas empregadas para avaliar impurezas.

O HPLC-PDA/UV, GC, LC MS, GC MS são as principais técnicas empregadas para identificar impurezas com um método analítico validado.

Pureza de pico e balanço de massa nos procedimentos de estudos de degradação forçada são requeridos, para comprovar a quantificação e performance do método. O balanço de massa é o “processo de somar todos os valores de produtos de degradação quantificados no procedimento e verificar o quanto essa soma se aproxima do valor inicial do analito, levando em consideração a margem de precisão analítica do método” . As impurezas acima dos limites de identificação devem ser consideradas na avaliação do perfil de impurezas para o IFA ou produto acabado.

Exemplo de análise para produtos de degradação, resultados de pureza de pico e balanço de massa.

Cada um dos picos não desconsiderados no cromatograma do produto deve ter sua área quantificada. Inicialmente, cada pico pode ser quantificado pela porcentagem que sua área representa em relação à soma de todas as áreas, ou por comparação da área deste pico com o de um padrão do fármaco injetado em concentração menor que na amostra.

MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO

Os  seguintes métodos podem ser usados para a determinação quantitativa de impurezas orgânicas:

a) Calibração externa: este método é usado para os ensaios e para a estimação de impurezas em uma dada amostra, nas quais as impurezas são quantificadas usando os padrões da própria impureza e sem o pico do padrão do IFA. É possível estimar a concentração usando a curva de calibração.

b) Normallização de área: se o RRF de uma impureza conhecida é relacionado com o IFA (isto é, de 0,9 a 1,1),  a normalização de área é uma boa escolha para a quantificação. A recuperação precisa ser estabelecida se musar o fator de resposta.

c) Método de diluição do padrão: se o RRF da impureza são diferentes em relação ao analito, o método de diluição do padrão pode ser escolhido para quantificação. O padrão do IFA deve ser diluído para alcançar valores similares aos limites de impurezas esperadas e os picos de impurezas devem ser quantificados pelo padrão do IFA.

d) Padrão interno: se o procedimento de preparo de amostra envolve diferentes  passos de extração, para evitar erros, um padrão interno pode ser escolhido (normalmente necessário para técnicas de derivatização e métodos bioanalíticos).

Fatores que  podem prejudicar o balanço de massa perfeito: a)Alguns produtos de degradação não são detectados e/ou integrados no cromatograma de resultados – estão abaixo do que o limite de detecção, não são detectáveis pelo tipo de detector, não apresentam interação/retenção pela coluna cromatográfica que está sendo usada, não é compatível com as condições de análise (pH de Fase Móvel, por exemplo) e não é compatível com o próprio preparo da amostra (diluente/técnica de preparo) b)Alguns produtos de degradação podem degradar e não se torna possível analisa-los. Ex: eles podem ser precipitados Alguns produtos podem ser voláteis.

Problemas com a quantificação cromatográfica:

As impurezas ou produtos de degradação podem ser de 2 tipos básicos – conhecidas ou desconhecidas. As conhecidas têm sua estrutura química conhecida e pode ser possível utilizar uma substância química de referência (padrão de mesma estrutura verdadeira) e a quantificação dessas poderá ser realizada por calibração externa.

As impurezas desconhecidas não permitem que se utilize a quantificação com calibração externa utilizando o próprio composto real como referência e neste caso é quantificado por porcentagem de área padronizada no próprio cromatograma (o que é um erro se não estivermos detectando todos os produtos da reação e se os produtos tiverem sensibilidades muito distintas); ou podem ser quantificados empregando o próprio ativo como referência. Neste caso também deve-se esperar que exista um erro grande pois seria necessário uma curva de calibração que cobrisse a faixa de concentração correta e seria necessário garantir que o padrão conseguisse representar o mesmo nível de sinal analítico gerado, sendo proporcional a concentração.

Assim, é muito mais favorável quantificar a redução do pico do ativo (maior precisão e exatidão) do que quantificar no que o ativo pode ter sido convertido (produtos de degradação) e estabelecer qual a concentração real dessas substâncias formadas (menor precisão e exatidão).

Então a pergunta é: como é possível realizar o balanço de massa real se não for possível quantificar todos os produtos de degradação com exatidão?

Discussão presente em nosso curso Produtos Degradação: RDC 53/2015 e Guia Anvisa -Visão Prática e Aplicada e Estabilidade de IFA e Medicamentos: RDC 318/2019 (para inscrições escreva cromvallab@gmail.com).

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